长期大剂量糖皮质激素可诱导TXNIP表达上调，TXNIP作用于血管内皮细胞和成骨细胞，下调VEGF和Wnt信号通路，使血管生成受阻，导致骨血管微循环障碍，造成血淤，骨形成功能下降，导致骨质疏松。因此，本实验将在既往的工作基础上，采用泼尼松复制GIO大鼠模型，揭示GIO状态下TXNIP-VEGE信号通路(TXNIP、VEGF/VEGFR2)以及TXNIP-Wnt信号通路(TXNIP/β-catenin)负调控骨形成的功能，阐明骨组织血瘀证微循环障碍在GIO发病中的分子机制及丹参素的干预作用。同时在体外培养人脐静脉融合内皮细胞(EA.hy926，EA)、人成骨样 MG63 细胞(MG)和大鼠原代培养成骨细胞(OB) ，以地塞米松(Dexamethasone，简写Dex)复制GIO细胞模型，加入丹参素进行干预，进一步明确骨组织TXNIP调控VEGF/Wnt通路对血管形成的影响，从而提示TXNIP介导的血淤证微循环障碍在GIO发病中的作用及丹参素的干预机制，为丹参素改善骨微循环和促骨形成等多靶点防治GIO提供新的实验依据。　　【目的】　　阐明TXNIP介导的血淤证微循环障碍在GIO发生和发展过程中的作用，并揭示丹参素防治GIO的分子机制。　　【方法】　　1. TXNIP介导的骨微循环障碍对GIO发病的影响及丹参素的干预作用　　1.1 54只4月龄雄性SD大鼠随机分为6组，每组9只，分别为：正常对照组(Con，给予CMC-Na)；丹参素组(Tan，25mg·kg-1·d-1)；醋酸泼尼松组(GC， 5mg·kg-1·d-1)；GC+丹参素组(GC+Tan)；GC+罗盖全组(GC+Cal，0.045μg·kg-1·d-1)；GC+活络效灵丹组(GC+HLXL，19g·kg-1·d-1)，上午灌胃醋酸泼尼松，下午灌胃干预药物，连续16周。在实验结束前第3，4，13和14天，每组随机选取6只大鼠皮下注射钙黄绿素（7mg·kg-1）进行体内荧光标记。实验结束当天，荧光标记的大鼠用3%戊巴比妥麻醉，右心室取血，分离血清，ELISA检测TXNIP及骨转换指标。取左侧股骨，采用动态生物力学检测系统检测左侧股骨骨生物力学性能，利用 Micro-CT检测左侧股骨远端骨微结构，对左侧胫骨近端进行不脱钙骨包埋观测荧光标记，测动态参数，提取右侧股骨总蛋白，用Western-blot法检测TXNIP/VEGF等相关蛋白表达水平。每组剩余的3只大鼠，进行MICROFIL造影灌注，取大鼠左股骨进行Micro-CT扫描，观察骨微血管的走行、相互联系方式以及分布范围等方面，得到血管容积比率(TV)、血管连接度(Conn.D)、血管平均厚度(Tb.Th)和血管间距(Tb.SP)等相关参数。　　2. 在细胞水平研究TXNIP介导的血管生成障碍对骨形成的影响　　2.1.选取人脐静脉内皮融合细胞(EA.hy926，本文简写EA)为实验对象，用Dex和Tan处理细胞，用MTT法、划痕法及Matrigel胶法检测EA细胞的增殖分化，迁移及体外成管能力，以观察地塞米松对内皮细胞迁移分化的影响及丹参素的干预作用。同时，用RT-PCR法检测地塞米松和丹参素对内皮细胞中TXNIP、VEGF等血管形成相关基因表达水平的影响，Western Blot 法检测地塞米松对内皮细胞中TXNIP、VEGF、Wnt通路中相关蛋白分子表达水平的影响及丹参素的干预作用，初步探讨TXNIP对血淤证微循环障碍的作用及丹参素的干预机制。　　2.2.选取人成骨样MG63细胞株(本文简写MG)及大鼠原代培养成骨细胞(OB)为实验对象，用MTT法检测细胞增殖能力，用硝基苯二磷酸地物法检测碱性磷酸酶(ALP)活性，观察Dex和Tan对细胞增殖和骨形成功能的影响；用RT-PCR法检测TXNIP、VEGF等血管形成相关基因的表达，用Western Blot 法检测TXNIP、VEGF、Wnt通路中相关蛋白的表达，揭示地塞米松对调控骨形成的信号通路的影响及丹参素的干预机制。　　【结果】　　1. 利用GIO大鼠模型研究骨微循环障碍对骨形成的影响及丹参素的干预作用　　1.1.体重变化：　　在16周的实验周期里，与CON组比较，GC组大鼠体重明显低于对照组(P<0.05) ，而单独给与TAN组大鼠体重与对照组大鼠接近；与GC组相比， GC+Tan、和GC+HLXL组大鼠体重都明显高于GC组大鼠。　　1.2.大鼠血清TXNIP及骨代谢指标变化：　　ELISA法检测大鼠血清中TXNIP及骨转换指标的结果表明，与Con组相比， GC组大鼠血清中PINP明显减少(P<0.05)，β-CTX和TXNIP明显增加(P<0.05)，而单独给与Tan，大鼠血清中PINP有减少的趋势，β-CTX和TXNIP有升高的趋势，但差异无统计学意义；与GC组比较，GC+Tan、GC+Cal组PINP血清水平明显升高(P<0.05)，β-CTX和TXNIP明显血清水平降低(P<0.05)；GC+HLXL组大鼠血清中TXNIP水平降低(P<0.05)，β-CTX水平升高(P<0.05)，而PINP血清水平无明显变化。　　1.3.大鼠骨微血管形成变化：　　Microfil骨微血管灌注造影结果显示，与Con组相比，单独给予Tan后大鼠股骨远端骨微血管比率有升高的趋势，骨微血管数量有增加的趋势；与Con组相比，GC组大鼠股骨远端骨微血管比率有明显下降的趋势，骨微血管数量有减少的趋势，骨微血管厚度、骨微血管分离度增加；而给予Tan，Cal和HLXL干预后，大鼠骨微血管体积比率有升高趋势，骨微血管数量呈现增加的趋势，骨微血管分离度有降低的趋势，差异无统计学意义。　　1.4.大鼠骨量与骨结构的变化：　　骨组织形态计量学结果显示，与Con组相比，GC可导致大鼠破骨细胞数及破骨细胞周长百分率明显升高(P<0.05)，胫骨上段松质骨骨小梁面积百分数，骨小梁厚度和骨小梁数目明显减少(P<0.05)，骨小梁分离度增加(P<0.05)，且骨小梁动态参数中荧光标记周长百分数、骨形成率和(BFR/TV)明显降低(P<0.05)；与GC组相比，GC+Tan组大鼠胫骨上段的破骨细胞周长百分数(%Oc.Pm)和破骨细胞数(OC.N/Tb.Pm)明显降低(P<0.05)；而松质骨骨小梁面积百分数及骨小梁数目(Tb.N)明显增加(P<0.05)，骨小梁分离度(Tb.SP)减少(P<0.05)，动态参数中荧光周长百分数%L.Pm明显增加(P<0.05)；胫骨中段动态参数中骨内膜荧光标记周长百分数(%E-L.Pm)和骨外膜骨形成率（P-BFR/BS）明显上升(P<0.05)，骨外膜荧光周长百分数(%P-L.Pm)有上升趋势。　　Micro-CT结果显示，与Con组相比，GC可导致大鼠股骨远端骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目（Tb.N）、体积骨密度(vBMD)下降(P<0.05)，骨小梁分离度(Tb.SP)增加(P<0.05)，单独给予Tan，大鼠大鼠股骨远端三维形态计量各指标与Con组接近，无明显变化；与GC组比较，给予Tan干预后，大鼠骨体积分数(BV/TV)，骨小梁骨连接密度(Conn-D)和体积骨密度(vBMD)上升(P<0.05)，骨小梁分离度Tb.SP降低(P<0.05)。　　1.5.大鼠骨生物力学性能变化：　　与Con组比较，GC组的Maximum load、Stiffness、Fracture load均明显降低(P<0.05)，单独给予Tan干预与Con组相比各项骨生物力学指标无明显差异；与GC组相比，GC+Tan组的大鼠，其股骨生物力学指标Maximum load、Elastic load和Stiffness依次增加7%、10%和7%（P>0.05)；GC+Cal组Maximum 和Fracture load 明显增加(P<0.05) ， Elastic load 和 Stiffness 依次增加 10%和7%(P>0.05)；GC+HLXL组大鼠，骨生物力学指标Maximum 、Fracture load依次增加7%和8%(P>0.05)，差异无统计学意义。　　1.6.GIO大鼠骨组织蛋白表达水平的影响及丹参素的干预作用　　（1）丹参素对GIO大鼠骨组织TXNIP表达水平的影响　　与Con组相比，GC处理组大鼠骨组织中TXNIP表达显著增加(P<0.05)；与GC组相比，GC+Tan组大鼠骨组织中TXNIP的表达均明显下降(P<0.05)，结果表明丹参素对GC引起的TXNIP表达上调有明显的抵抗作用。　　（2）丹参素对GIO大鼠骨组织中VEGF蛋白表达水平的影响　　与Con组相比，GC处理组大鼠骨组织中VEGF表达显著下降(P<0.05)；而与Con组相比，Tan处理组大鼠骨组织中VEGF表达显著增加；与GC组相比，GC+Tan组和GC+Cal组大鼠骨组织中VEGF表水平均显著增加(P<0.05)。结果表明，丹参素对GC导致的血管内皮因子VEGF表达下调有逆转的作用。　　（3）丹参素对GIO大鼠骨组织中β-catenin蛋白表达水平的影响　　与Con组相比，GC处理组大鼠骨组织中β-catenin蛋白的表达有下降的趋势；Tan处理大鼠骨组织中β-catenin蛋白表达显著增加(P<0.05)；与GC处理组相比， GC+Tan组和GC+Cal组大鼠骨组织中β-catenin蛋白表达显著增加(P<0.05)。结果表明，丹参素可促进大鼠骨组织中β-catenin蛋白表达，并对GC引起的Wnt通路中β-catenin蛋白表达下调有逆转作用。　　2. 在细胞水平探索TXNIP负调控血管生成对骨形成的作用及丹参素的干预机制　　2.1.血管形成分析　　2.1.1.地塞米松对EA细胞活力的影响：　　MTT结果显示，与Con组相比，地塞米松1×10-5mol/L作用24h即可显著 地抑制EA细胞的增殖，且抑制作用随时间增强（P<0.05）；而DEX 1×10-6mol/L在作用48h和72h可明显抑制EA细胞的增殖(P<0.05)，(1×10-7～1×10-9)mol/L浓度组在作用24h对EA细胞增殖有明显地促进作用(P<0.05)，48h对EA细胞无明显作用，在72h时有明显地抑制作用(P<0.05)。　　2.1.2.丹参素对EA细胞活力的影响：　　MTT结果显示，与Con组相比，1×10-7mol/L浓度组丹参素作用24h～48h可明显促进EA细胞的增殖(P<0.05)，而在72h却有明显地抑制作用（P<0.05）；而丹参素1×10-8mol/L在作用24～48h可促进EA细胞的增殖(P<0.05)，而72h对EA细胞增殖无明显作用，1×10-10mol/L浓度组在作用72h对EA细胞增殖有明显地抑制作用(P<0.05)，而其他浓度组对EA细胞增殖无明显作用。　　2.1.3.地塞米松和丹参素对EA细胞迁移功能的影响：　　划痕法结果显示，与Con组相比，丹参素和MG细胞培养液对EA细胞的迁移有促进作用(P<0.05)；地塞米松可明显抑制EA细胞的迁移能力(P<0.05)；丹参素和MG细胞培养液干预处理后，可恢复EA细胞得迁移能力(P<0.05)。　　2.1.4.丹参素和地塞米松对EA细胞体外成管能力的影响：　　Matrigel法检测结果显示，与Con组相比，Tan可促进EA细胞体外血管形成(P<0.05)，而Dex对EA细胞体外血管形成有抑制作用(P<0.05)，MG细胞培养液对EA细胞体外成管无明显作用。　　2.1.5.地塞米松及丹参素对EA细胞TXNIP及血管形成相关基因表达的影响：　　RT-PCR结果显示：地塞米松处理EA细胞24h细胞内TXNIP 基因表达水平有增加的趋势；与Con组相比，丹参素组细胞中VEGF 基因表达水平明显升高，而VEGFR2有升高的趋势(P>0.05)；而Dex组细胞中VEGF和VEGFR2 的基因表达水平明显降低(P<0.05)。　　2.1.6.地塞米松及丹参素对MG细胞中TXNIP及血管形成相关基因表达的影响：　　RT-PCR结果显示：与Con组相比，Dex处理可使MG细胞中TXNIP的基因明显增多(P<0.05)，VEGF 的基因表达水平明显下降(P<0.05)，VEGFR2的基因表达水平有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与Con组相比，Tan处理组MG细胞中TXNIP的基因表达水平无明显变化，而VEGFR2 的基因表达水有增加的趋势，VEGF 的基因表达无明显变化。　　2.1.7.地塞米松及丹参素对EA细胞TXNIP及血管形成相关蛋白表达水平的影响：　　蛋白免疫印迹结果显示：与Con组相比，Dex组细胞中TXNIP蛋白表达水平升高（P<0.05），VEGF/VEGFR2蛋白表达水平无明显变化；Tan可促进EA细胞中VEGF/VEGFR2蛋白的表达（P<0.05），降低TXNIP表达水平；与Dex组相比，Dex+Tan可促进EA细胞中VEGF/VEGFR2蛋白的表达（P<0.05）。　　2.1.8.地塞米松及丹参素对MG细胞TXNIP及血管形成相关蛋白表达水平的影响：　　与 Con 相比， Dex 可使 MG 细胞中 TXNIP 蛋白的表达水平明显升高（P<0.05）；而与Dex组相比，Dex+Tan可使MG细胞中TXNIP蛋白的表达水平明显降低（P<0.05），表明丹参素可抵抗地塞米松引起的TXNIP水平升高;与Con组相比，Tan可明显促进MG细胞中VEGF蛋白的表达（P<0.05），而Dex对MG细胞中VEGF/VEGFR2蛋白表达水平无明显影响；与Dex组相比， Dex+Tan可促进MG细胞中VEGF/VEGF蛋白的表达（P<0.05）。　　2.2.骨形成分析　　2.2.1.MTT法检测不同浓度的塞米松对MG细胞增殖活力的影响：　　与Con组相比，各浓度组地塞米松在作用24h对MG细胞增殖活力没有明显作用，而(1×10-5～1×10-8)mol/L浓度的地塞米松在作用48h和72h后对MG细胞有明显的抑制作用(P<0.05)，而1×10-9 mol/L浓度的地塞米松在作用72h后对MG细胞增殖活力有明显的抑制作用(P<0.05)。　　2.2.2.MTT法检测不同浓度的丹参素对MG细胞增殖活力的影响：　　与Con组相比，(1×10-7～1×10-9)mol/L浓度的丹参素在作用24h对MG细胞有抑制作用，1×10-9和1×10-5mol/L浓度的丹参素在作用48h和72h后对MG细胞活力有明显的促进作用(P<0.05)，(1×10-5～1×10-7) mol/L浓度的丹参素在作用72h后对MG细胞活力有明显的促进作用(P<0.05)。　　2.2.3.地塞米松对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响:　　与Con组相比，Dex (1×10-7～1×10-5)mol/L浓度组在作用3、5、7、9天后均有不同程度地抑制碱性磷酸酶表达作用(P<0.05)。Dex 1×10-8mol/L浓度组随着作用时间的延长，对ALP活性有抑制的趋势，Dex 1×10-9mol/L浓度组对ALP 活性没有明显的影响。　　2.2.4.丹参素对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响：　　与Con组相比，Tan (1×10-9～1×10-8)mol/L浓度组在作用3、5、7、9天后可不同程度地促进碱性磷酸酶的表达(P<0.05)。Tan(1×10-7～1×10-5)mol/L浓度组随着作用时间的延长，在作用7天时表现出促进ALP活性的作用(P<0.05)，但在9天时作用效果消失。　　2.2.5.地塞米松及丹参素对成骨细胞矿化形成的影响：　　与Con组相比，丹参素处理大鼠成骨细胞21d可促进其矿化形成，而地塞米松作用21天对大鼠成骨细胞的矿化有抑制作用。　　2.2.6.地塞米松及丹参素对EA细胞中β-catenin蛋白表达水平的影响：　　蛋白免疫印迹结果显示，与对照组相比，Dex组细胞中β-catenin蛋白分子表达水平明显降低(P<0.05)；与Dex组相比，Dex+Tan组细胞中β-catenin蛋白分子表达水平明显增加(P<0.05)。　　2.2.7.地塞米松和丹参素对MG细胞中β-catenin蛋白表达水平的影响　　蛋白免疫印迹结果显示，与Con组相比，Tan和EA细胞培养处理组MG细胞中β-catenin蛋白表达水平升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；Dex处理组MG细胞中β-catenin蛋白表达水平下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，而与Dex处理组相比，D+T处理组细胞中β-catenin蛋白表达水平升高(P<0.05)。　　【结论】　　1. 长期大剂量使用糖皮质激素可导致大鼠骨微循环障碍，使大鼠骨形成，骨修复功能受损，从而导致GIO。　　2. GC可导致大鼠骨组织TXNIP蛋白表达水平升高，下调VEGF/VEGFR2和Wnt/β-catenin信号通路，造成骨微循环障碍和骨形成减少。　　3. 丹参素及其复方制剂可促进内皮细胞增殖迁移分化和体外血管形成功能，促进GIO大鼠骨微血管形成，从而改善GC导致的骨微循环障碍，同时激活成骨细胞骨形成作用，减少GIO大鼠骨量丢失，改善GIO大鼠骨微结构和骨生物力学，从而发挥预防GIO作用，其作用机制可能与抑制GC引起的TXNIP高表达，上调VEGF/VEGFR2和Wnt/β-catenin信号通路有关。