AFB1诱导的B-2A13恶性转化细胞中circRNA-miRNA-mRNA的筛选及其作用的初步研究

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目的:筛选与AFB1诱导的P50B-2A13细胞恶性转化相关的circRNAs、miRNAs、mRNAs,探索circRNA-miRNA-mRNA在AFB1诱导B-2A13细胞恶性转化中的靶向调控作用。方法:首先用miRNA芯片、mRNA芯片和cricRNA芯片检测经AFB1诱导的P50B-2A13恶性转化细胞以及同期对照细胞(P50B-Vector细胞)中miRNAs、mRNAs和circRNAs表达谱,比较分析这两种细胞之间差异表达的miRNAs、mRNAs和circRNAs。以miRNA为中心,采用TargetScan软件分析了差异表达的miRNAs靶基因,将这些靶基因与差异表达mRNA相匹配,保留共有的且表达水平相反的miRNA-mRNA调控关系,根据miRNA与circRNA靶向关系,通过筛选出的miRNAs在circRNA-miRNA库中找到对应的差异表达的circRNA,初步构建circRNA-miRNA-mRNA调控关系。结合pathway分析和疾病富集分析筛选出与肺癌可能相关的mRNAs,通过RT-qPCR对关键mRNAs,miRNA及circRNA进行验证。采用western blot验证mRNA在蛋白水平的表达。最后用瞬时转染siRNA干扰方法抑制ID3和FGF5基因的表达,用平板克隆和划痕愈合实验检测它们对P50 B-2A13细胞的增殖与迁移的影响。结果:(1)在P50B-2A13细胞和P50 B-Vector细胞之间,miRNA芯片分析得到差异表达的miRNAs有60个,其中表达上调的有37个,表达下调的有23个,mRNA芯片分析得到差异表达的mRNAs有1014个,其中表达上调的有771个,表达下调的有243个,circRNA芯片分析得到差异表达的circRNAs有4313个,其中表达上调的有1496个,表达下调的有2812个。(2)对差异表达的miRNAs、mRNAs和circRNAs靶向关联分析得到GJA1、ID3和FGF5为候选功能靶基因,miR-23c 等 6 个 miRNAs 为调控中心以及 hsacirc0002842 等 85 个 circRNA 为海绵作用的调控关系。(3)RT-qPCR验证表明,miRNAs和mRNAs的表达和芯片结果高度一致,circRNA的表达与芯片结果一致性达到80%。(4)在P50-B-2A13细胞中,敲减ID3可以明显抑制细胞的克隆形成能力,但抑制FGF5对细胞克隆形成能力影响不大;抑制ID3和FGF5对划痕愈合都能起到一定的抑制作用,在划痕24h之后,空白组(P50 B-2A13)、对照组(P50 B-2A13+Negative control)、敲降ID3(P50B-2A13+ID3-siRNA)和敲降 FGF5(P50B-2A13+FGF5-siRNA)划痕愈合度分别为 53.9%、51.1%、38.8%和 30.6%。结论:(1)以差异表达的miRNA为中心的靶向关联分析,结合肿瘤相关的差异表达的mRNA,初步发现以GJA1、ID3和FGF5为功能基础,miR-23c等多个miRNAs为调控中心、hsacirc0002842等多个circRNA为海绵作用的调控关系可能与AFB1诱导的B-2A13细胞恶性转化相关。(2)ID3对恶性转化的P50 B-2A13细胞的克隆形成能力和划痕愈合能力有一定的影响;FGF5虽然对细胞克隆形成能力的影响不显著,但可影响细胞的划痕愈合能力。
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