【摘 要】
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目的:（1）制备不同浓度的光交联透明质酸-聚乙二醇水凝胶支架,并对该水凝胶的理化性质进行表征,对生物相容性进行测试。（2）完成兔的骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定。（3）构建兔的BMSCs/透明质酸-聚乙二醇水凝胶支架复合体;并研究该水凝胶对骨髓间充质干细胞的增殖、分化的影响。方法:（1）制备光交联透明质酸-聚乙二醇水凝胶支架:在透明质酸水溶液里依次加入一定量的EDC,NHS,N-（3-氨基丙
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目的:（1）制备不同浓度的光交联透明质酸-聚乙二醇水凝胶支架,并对该水凝胶的理化性质进行表征,对生物相容性进行测试。（2）完成兔的骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定。（3）构建兔的BMSCs/透明质酸-聚乙二醇水凝胶支架复合体;并研究该水凝胶对骨髓间充质干细胞的增殖、分化的影响。方法:（1）制备光交联透明质酸-聚乙二醇水凝胶支架:在透明质酸水溶液里依次加入一定量的EDC,NHS,N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺。调节反应混合物溶液的p H为6.5,在常温下反应12h,12h后加入等量的EDC、NHS和N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺,继续反应12h。冷冻干燥3d得到;再将一定量的甲基丙烯酰化透明质酸、聚乙二醇二丙烯酸酯与光交联剂混合,在紫外光照射一定时间,制备不同浓度的光交联透明质酸-聚乙二醇水凝胶;通过电镜观察不同浓度水凝胶的内部结构,通过溶胀实验测量不同浓度水凝胶的溶胀率,通过降解实验体外模拟该水凝胶的降解性能,通过万能力学试验机测量压缩模量,通过CCK8法测量不同浓度水凝胶的生物相容性。（2）分离、培养及鉴定兔的BMSCs:通过全骨髓贴壁法进行分离培养和纯化BMSCs;通过光学显微镜观察细胞形态,通过流式细胞仪检测表面标志物来鉴定该细胞。通过CCK8法研究不同浓度水凝胶对干细胞的增殖作用,选择增殖效果最好的浓度组水凝胶和BMSCs进行成骨诱导分化培养21天,研究该水凝胶对BMSCs成骨分化影响。通过茜素红染色、碱性磷酸酶定性、定量分析和荧光定量PCR测量成骨分化相关标志基因表达来比较各组对干细胞成骨分化的影响。结果:（1）通过傅立叶变换红外光谱仪和核磁共振氢谱仪证实透明质酸已被甲基丙烯酰化,成功合成了甲基丙烯酰化透明质酸。通过将一定量的甲基丙烯酰化透明质酸、聚乙二醇二丙烯酸酯和LAP溶解于水溶液中,用紫外光照射30s即可成功制备出不同浓度的光交联透明质酸-聚乙二醇复合水凝胶支架;通过分别对不同浓度的光交联透明质酸-聚乙二醇水凝胶的冻干样品在电镜观察发现,H4P1浓度组的孔隙较H3P1和H2P1浓度组整体结构紧密、孔壁四周完整、孔隙直径更小、密度更大;通过溶胀实验,得到H4P1的溶胀性能较H3P1和H2P1浓度组小。通过模拟人体透明质酸的降解,证实H4P1组的降解性能较H3P1和H2P1组浓度组差。通过水凝胶的力学性能,得到H4P1组较H3P1和H2P1浓度组的压缩模量高。通过比较交联剂LAP和I2959对水凝胶凝胶时间的影响,得出交联剂LAP较I2959的促凝胶时间快。通过CCK8实验证明H4P1浓度组的吸光度较H3P1和H2P1浓度组高,具有良好的生物相容性。（2）通过对提取的贴壁细胞进行鉴定,已成功提取出骨髓间充质干细胞;通过CCK8实验表明,水凝胶H4P1浓度组的吸光度更高,较H3P1和H2P1浓度组具有更好的增殖效果。实时荧光定量PCR结果显示,相比于空白对照组,与水凝胶结合的骨髓间充质干细胞成骨分化标志基因Runx2和OPN的表达明显增加,P＜0.05,表明该光交联透明质酸-聚乙二醇水凝胶具有促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力。结论:（1）HA-Ac与PEGDA在加入光交联剂后可以快速合成光交联透明质酸-聚乙二醇复合水凝胶支架,其具有较好的孔隙率、压缩模量、溶胀率和生物相容性;不同浓度的光交联透明质酸-聚乙二醇水凝胶中,H4P1组较H2P1组和H3P1组有着较为致密的孔隙、较强的压缩模量、较小的溶胀率、不易降解性和更好的促细胞增殖和分化效果;（2）通过全骨髓贴壁法可分离培养出活性较好的骨髓间充质干细胞;光交联透明质酸-聚乙二醇水凝胶可以促进该细胞的增殖和向成骨细胞分化。
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