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恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康。手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的常用方法。但放疗和化疗因同时杀伤肿瘤细胞和正常细胞，副作用极大；而且化疗药物还有药效低的缺点。细胞毒素的介入治疗是一类针对肿瘤细胞进行治疗的新方法，通过介入手段直接将生物毒素注入肿瘤组织，从而有效避免了传统放化疗的缺点，成为当前肿瘤治疗的有效手段。
铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A，PE)是分子量为66KD的单链蛋白质，通过延伸因子-2的ADP-核糖基化抑制真核细胞的蛋白质合成而导致细胞死亡；它是自然界存在的毒性最强的分子之一，杀细胞作用远高于化学抗癌药物，一个或少数几个毒素分子足以杀死一个哺乳动物细胞，因此PE常被用于构建免疫毒素。PEⅢ是PE的酶活性区域，分子量仅有25KD，具有较强毒性，而且具有分子量小的特点，更具有开发利用的价值。尽管PEⅢ作为一种新型小分子治疗药物具有广阔的应用前景，但因其穿透性较差，在临床应用中明显受限。
近年发现的穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一类具有细胞生物膜穿透功能的肽类物质，其中来源于HIV-1 Tat的蛋白转导域(protein transduction domain，PTD)能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，是一种很有前途的运载工具。同时也能有效解决毒素穿透性弱的问题。
在前期的研究中已经证实TAT-PE融合蛋白在体内外均具有一定的抗肿瘤活性，本研究正是在此基础上，通过细胞活性实验来验证TAT的穿膜性质，然后再通过PEⅢ、TAT-PEⅢ蛋白对肿瘤细胞毒活性的对比，进一步研究与鉴定TAT-PEⅢ在未来作为抗癌药物应用的价值。
基于上述，本文克隆了EGFP、TAT-EGFP和PEⅢ基因，构建pQE-EGFP、pQE-TAT-EGFP、pQE-PEIII表达质粒，转化JM109后，经表达、纯化获得EGFP、TAT-EGFP和PEⅢ蛋白；通过EGFP和TAT-EGFP蛋白体外活性检测，验证了TAT的穿膜活性，最后，通过对PEⅢ和TAT-PEⅢ蛋白体外抑瘤活性的鉴定来探讨其作为介入治疗抗癌药物的应用前景。其实验内容和实验结果主要包括以下几个方面：
1.EGFP、TAT-EGFP基因的克隆、表达纯化：①pQE-EGFP重组质粒的构建、表达纯化：以pEGFP-N2重组质粒为模板，用PCR方法扩增EGFP目的基因，与pQE-31表达质粒经连接，转化大肠埃希菌JM109，获得的E coli JM109/pQE-EGFP表达产物经超声裂菌后，80％以上的融合蛋白存在于上清中，表明实现了EGFP的可溶性表达。表达蛋白粗提物经亲和层析纯化、离子交换层析后获得了EGFP蛋白。②pQE-TAT-EGFP重组质粒的构建、表达纯化：以pQE-EGFP重组质粒为模板，将HIVTat PTD碱基序列引入扩增EGFP的上游引物中，用PCR方法扩增同时含有Tat PTD和EGFP片段的目的基因。与pQE-31表达质粒经连接，转化JM109大肠埃希菌，获得的pQE-TAT-EGFP/ JM109工程菌表达产物经超声裂菌后，80％以上的融合蛋白存在于包涵体中，表明TAT-EGFP融合蛋白是包涵体表达形式。表达蛋白粗提物经亲和层析纯化，一步即可获得TAT-EGFP蛋白。
2.TAT穿膜活性研究：通过EGFP、TAT-EGFP作用于体外活细胞B16，分别测定EGFP和TAT-EGFP蛋白对B16细胞的穿膜活性，结果验证了TAT具有穿膜活性。
3.pQE-PEⅢ/JM109工程菌的制备①以pQE-PEA重组质粒为模板，用PCR方法扩增PEⅢ片段的目的基因。②将目的基因插入原核表达载体pQE-31中，重组质粒命名为pQE-PEⅢ。将pQE-PEⅢ重组质粒转化大肠埃希菌JM109，筛选到了表达稳定的pQE-PEⅢ/JM109工程菌。
4.PEⅢ、TAT-PEⅢ融合蛋白的纯化与复性：①将pQE-PEⅢ/JM109和本室前期制备的pQE-TAT-PEⅢ/JM109工程菌放大表达，分别制备融合蛋白包涵体，将包涵体溶于8mol/L尿素中。②PEⅢ融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现TAT-PEⅢ融合蛋白的一步纯化。③TAT-PEⅢ融合蛋白经Ni-NTA柱亲和层析以及阴离子交换层析纯化后，获得了大小相符的单一条带的目标蛋白。④纯化好的PEⅢ、TAT- PEⅢ融合蛋白经透析复性后，冻存备用。
5.PEⅢ、TAT-PEⅢ蛋白的体外抑瘤活性研究：采用细胞凋亡检测法中的AnnexinV/PI双染色法染色，进行流式细胞分析，测定并比较了PEⅢ、TAT- PEⅢ融合蛋白对肿瘤细胞的体外抑瘤活性，结果表明TAT-PEⅢ融合蛋白对B16黑色素瘤细胞的杀伤活性较PEⅢ更高，结果显示：TAT-PEⅢ融合蛋白具有高效的抗肿瘤作用。
综上所述，本研究通过分子克隆技术、PCR扩增EGFP、TAT-EGFP基因，制备EGFP、TAT-EGFP蛋白，分别作用于体外培养小鼠黑色素瘤细胞B16，以此来进行TAT穿膜活性的研究；通过构建pQE-PEⅢ重组质粒，与本室前期构建的pQE-TAT-PEⅢ/JM109工程菌一起进行表达纯化，获得具有细胞毒活性的PEⅢ和TAT-PEⅢ蛋白，随后将PEⅢ和TAT-PEⅢ蛋白对体外培养的B16细胞作用，进一步探讨TAT-PEⅢ融合蛋白的抑瘤活性，为TAT-PEⅢ融合蛋白作为抗癌药物的临床应用前景奠定了基础。