现代化工业进程的快速发展导致人类及各种生物接触到越来越多的内分泌干扰物(endocrine disrupting chemical, EDC),从而对人类及动物的健康,尤其是生殖健康造成巨大的潜在危害。氧化损伤是EDC产生毒性作用的重要机制之一,因此积极探索可以有效预防及缓解氧化损伤方法是生殖毒理学研究的热点。黄酮类物质是植物界普遍存在的一种多酚类物质,研究表明,抗氧化功能是黄酮类物质的一个基本性质。它可以直接清除自由基,或通过螯合过渡性金属离子来抑制活性氧物质的生成。然而,黄酮类物质的对生殖系统的保护机制尚未完全阐明,因此,本研究从在体实验及体外细胞培养实验两方面研究了黄酮类物质槲皮素(quercetin)对两种典型的EDC,包括无机物镉(cadmium)和有机物3-甲基-4-硝基酚(3-methyl-4-nitrophenol, PNMC)生殖毒性的缓解作用,为探明EDC的毒性机制及防治提供了理论指导。1.镉对性腺的作用及槲皮素对镉引起的小鼠睾丸损伤的缓解作用镉是一种有毒重金属,作为无机内分泌干扰物的典型代表,广泛存在于人类的生活环境中。镉可以对生殖系统如睾丸组织造成损害,因此本试验对镉的睾丸毒性作用机理进行了探讨,研究了抗氧化物槲皮素对镉引起睾丸毒性的缓解作用。比较了饮水及腹腔注射两种染毒途径下镉对性成熟小鼠睾丸的损伤作用。饮水染镉2周后,4 mg/kg剂量的镉可引起睾丸生殖细胞的损伤及脱落,8 mg/kg剂量的镉可引起睾丸生精上皮的严重破坏。而一次性腹腔注射染毒后,25 mg/kg剂量的镉可引起睾丸的严重损伤,睾丸充血肿胀,血细胞分布于整个睾丸间质中,且生精上皮遭到严重破坏。以上两种途径及剂量染镉都会造成附睾内精子的损伤。对睾丸组织生化指标的检测显示,镉导致睾丸活性氧生成及脂质过氧化程度增加,同时耗竭抗氧化物质谷胱甘肽(glutathione, GSH)及抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase. SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)。镉还激活了促凋亡蛋白Bax和caspase-3的表达并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,经线粒体信号途径引起生殖细胞的凋亡。槲皮素作为天然抗氧化物质,可以有效缓解镉的睾丸毒性。本研究发现,槲皮素(75 mg/kg)可以有效降低镉引起的活性氧的生成,并抑制脂质过氧化的发生。槲皮素可以有效改善组织的抗氧化能力,增加GSH水平并提高SOD和GSH-Px活力,从而增强组织清除活性氧的能力。此外,槲皮素还可以有效调节镉引起的生殖细胞的凋亡,提高抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达并抑制促凋亡蛋白Bax及凋亡效应因子caspase-3表达,进而阻止凋亡信号的启动。研究了可导致成熟雄性小鼠睾丸损伤剂量的镉对成熟雌性小鼠卵巢的影响。病理组织切片结果显示,所有处理组小鼠的卵巢形态良好,有不同发育阶段的卵泡存在。但镉处理后小鼠卵巢内发育中的卵泡数量似乎增多,总的卵泡数量明显多余对照组小鼠,且存在剂量依赖性,最高剂量的镉处理后总的卵泡数量有下降的趋势。通过TUNEL免疫组织化学染色鉴定细胞凋亡发现,所有处理小鼠的卵巢内未发现有凋亡细胞存在。说明雌性动物对内分泌干扰物的损伤作用的抵抗力要比雄性动物强。2.槲皮素对镉引起的精原细胞氧化损伤的缓解作用前期的研究结果表明镉可以引起多种生殖细胞的损伤,其中精原细胞是成年雄性动物生殖细胞产生的源泉,通过研究镉对精原细胞的毒性作用机理可以为保护雄性精子发生提供理论指导。利用6日龄小鼠建立了睾丸精原细胞-体细胞共培养模型。以DMEM为基础培养基,并添加L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白及亚硒酸钠等因子可以维持精原细胞在体外的存活及增殖。精原细胞称圆形且粘附于体细胞之上生长,常以一个或多个聚集在一起的形式存在。不同剂量的镉处理精原细胞后发现(1、2和4μmol/L),当镉剂量超过2μmol/L时可以剂量依赖性地引起精原细胞的损伤,且氧化应激是导致精原细胞损伤的重要原因。镉处理后精原细胞数量减少,细胞活性降低,脂质过氧化程度提高,抗氧化物质GSH及抗氧化酶SOD酶活性受到显著抑制。槲皮素可以有效缓解镉对精原细胞的损伤作用。槲皮素增加了精原细胞的数量及活性,抑制了MDA的生成,并恢复了GSH水平及SOD活性。这些结果表明,无论是在体还是离体试验,都证明了氧化应激是镉产生生殖毒性的原因之一,而槲皮素可以通过有效清除活性氧的产生,抑制脂质过氧化,提高抗氧化系统的能力,抑制细胞的凋亡等对细胞及组织形成保护作用。3.槲皮素对PNMC引起的睾丸损伤的缓解作用随着交通工具的日益普及,汽车尾气的污染问题日益严重。除了气体污染外,在尾气中还含有大量有机颗粒性物质,这些颗粒物可对人类及各种动物的生殖功能造成危害。本试验研究了柴油尾气成分之一的PNMC的生殖毒性作用,并探讨了抗氧化物槲皮素对PNMC引起的睾丸毒性的缓解作用。通过腹腔注射方式使小鼠染毒,研究了PNMC对性成熟小鼠的睾丸毒性作用。发现一次性高剂量(100 mg/kg)接触后,PNMC可以引起小鼠睾丸的局部严重损伤,表现为睾丸曲细精管的损伤,生精上皮中生殖细胞数量显著减少。PNMC显著增加睾丸组织羟自由基(hydroxyl radical,·OH)、过氧化氢(H2O2)等活性氧的生成,导致脂质过氧化发生,破坏了抗氧化系统,并改变线粒体中抗凋亡蛋白Bcl-XL及促凋亡蛋白Bax的表达水平,激活细胞caspase-3活性,引起生殖细胞的DNA损伤,最终导致生殖细胞的凋亡。而抗氧化物槲皮素与PNMC联合处理则可以有效缓解后者造成的睾丸毒性作用。槲皮素联合处理后,小鼠睾丸生精上皮形态完整,睾丸组织羟自由基、过氧化氢等活性氧水平显著降低,组织脂质过氧化程度显著受到抑制,Bcl-XL阳性细胞数量显著增多,而Bax阳性细胞数量显著减少,caspase-3活性也受到明显的抑制,生殖细胞TUNEL阳性数量显著降低。这些结果说明氧化损伤是PNMC引起雄性生殖毒理的重要原因之一,而槲皮素因具有抗氧化及抗凋亡等作用不但可以缓解无机物镉的睾丸毒性,也可以有效缓解有机物PNMC引起的睾丸损伤。以上结果表明,镉及PNMC都可以引起雄性小鼠的睾丸损伤,且损伤与氧化应激有关,表现为活性氧生成的增加,脂质过氧化提高,组织抗氧化能力的抑制,线粒体凋亡途径(Bax/Bcl-XL)的激活,凋亡效应酶caspase-3的活化,并引发生殖细胞凋亡的发生。而槲皮素作为一种天然抗氧化物质可以有效清除活性氧的生成,抑制脂质过氧化,调节凋亡相关蛋白的表达,并有效缓解镉及PNMC引发的生殖细胞凋亡。