两面针Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.来源于芸香科花椒属植物，广泛分布于广西、广东、福建等地，是中国民间常用的传统中药材之一，具有行气止痛，活血化瘀，通络祛风等功效。现代药理学研究表明，两面针根部提取物有抗炎、抗菌、抗肿瘤等活性，两面针根化学成分的研究有待进一步深入。两面针根中主要含有生物碱类、香豆素类、木脂素类和萜类等成分，文献报道生物碱为主要活性成分。氯化两面针碱(nitidine chloride，NC)是从两面针根中分离得到的生物碱类主要活性成分之一，大量研究表明，NC具有良好的广谱抗肿瘤活性，可诱导包括胃癌、结直肠癌在内的多种肿瘤细胞凋亡。本课题组前期研究已证实，NC能显著抑制肝癌细胞增殖，但是其作用机理有待进一步深入研究。　　目的：　　本文对两面针根水提物的化学成分开展研究，寻找具有抗肿瘤活性化学成分，为进一步活性评价及机理研究提供化学基础及实验依据;提取分离得到NC用于后续药理学实验研究;采用定量蛋白质组学技术、生物信息学分析技术与分子生物学技术从整体和全局的角度研究NC对肝癌细胞蛋白表达的影响，探讨NC发挥抗肝癌的分子机制。　　方法：　　1.采用溶剂法与色谱法对两面针根水提取物进行分离。运用1H NMR，13C NMR，ESI-MS，HMBC等谱学分析技术对分离得到的化合物进行结构鉴定。应用HPLC分析技术，面积归一化法分析NC的纯度。采用MTT法检测化合物对肝癌细胞Bel-7402的增殖抑制率。　　2.应用流式细胞术检测NC诱导肝癌细胞Bel-7402的凋亡作用。免疫印迹技术检测NC处理后细胞内Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3等与凋亡相关蛋白的表达水平。　　3.采用半数抑制浓度的NC与Bel-7402共孵育24h后，应用基于同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)的蛋白质组学技术寻找经NC处理前后Bel-7402差异表达蛋白群，通过生物信息学分析技术寻找NC作用的潜在靶点。运用免疫印迹技术及JC-1染色法验证蛋白质组学结果。运用免疫印迹技术和实时荧光定量PCR技术检测NC对Bel-7402肝癌细胞中JNK、ERK、p38的mRNA及蛋白表达水平。　　结果：　　1.从两面针根水提部位中共分离纯化得到12个化合物，目前鉴定了其中的9个化合物的结构，其中7-羟基香豆素和芹菜素为首次从本植物中分离得到。富集NC样品并应用HPLC技术，采用面积归一化法分析其纯度大于98％，说明药物纯度可用于药理研究。MTT实验结果显示氯化两面针作用于肝癌细胞Bel-7402后，对细胞生长有显著增殖抑制作用(p＜0.05)，NC作用24h的IC50为5.058±0.438μg/ml。　　2.与空白对照组相比，NC处理后Bel-7402凋亡率显著上升(p＜0.05)，Bax，Bcl-2，cleaved-caspase-3等凋亡相关蛋白的表达显著升高(p＜0.05)。　　3.iTRAQ定量结果显示，NC处理后肝癌细胞线粒体相关蛋白表达升高;诱导c-Jun蛋白表达上调，变化倍数(Fold change，FC)为4.36±0.23倍;诱导c-Jun上游.JNK蛋白表达上调，FC=1.22±0.19;JC-1染色实验表明NC处理后细胞线粒体膜电位下降，线粒体受损严重;免疫印迹法证明NC处理后细胞内c-Jun、p-c-Jun、LC3-B蛋白表达上调，HO-1、p62蛋白表达下调(p＜0.05)，结果与iTRAQ定量结果一致，说明iTRAQ定量结果可靠;与空白对照组相比，NC作用后JNK的mRNA和蛋白表达均显著提高(p＜0.05)。　　结论：　　1.从两面针根水提部位中提取分离并鉴定得到9个化合物，包括2个香豆素类化合物，1个黄酮类化合物和6个生物碱类化合物。其中7-羟基香豆素和芹菜素为首次从本植物中分离得到;MTT结果表明NC能显著抑制肝癌细胞Bel-7402的增殖，24h的IC50为5.058±0.438μg/ml。　　2.NC能诱导肝癌细胞Bel-7402凋亡，采用5μg/ml浓度NC处理细胞24h后，观察到促凋亡蛋白Bax与抑凋亡蛋白Bcl-2的表达比值达到最大，以5μg/ml NC浓度为蛋白质组学实验浓度。　　3.NC处理后c-Jun蛋白及其上游JNK蛋白表达增高，NC发挥抗肝癌活性与JNK和c-Jun信号级联激活有关。