研究背景：膀胱癌是我国最常见的泌尿系恶性肿瘤。膀胱癌的发生发展的生物学机制尚未完全明确,要研究膀胱癌及其治疗方法,开发治疗药物,建立理想的动物模型是必不可少的。由于原位移植模型能在动物上更好的模拟膀胱癌在人体中的生长情况,所以在众多的膀胱癌模型方法当中,当前大多数学者都致力于膀胱癌原位移植模模型的研究。膀胱癌原位移植模模型的建立方法也有很多,通常都是采用不同的方法破坏膀胱粘膜再灌注肿瘤细胞或者开腹直接将肿瘤细胞种植到膀胱壁内来构建模型。其中开腹直接将肿瘤细胞种植到膀胱壁内的方法具有成瘤率极高、成瘤时间短等优点,现已被广泛应用。但存在对动物损伤大,易感染等缺点,更简便、损伤更小的构建方法成为一个研究热点。通过我们自制的简易工具经尿道进行膀胱粘膜的切割能有效的损伤膀胱粘膜且能对损伤的位置具有选择性,对动物的损伤也更小。对已生长肿瘤的动物,传统的方法是在一定时间内的某几个特定的时间杀死动物进行观察,但随着分子影像学在近几年的飞速发展,使得对动物模型进行实时、非侵入性的观察已成为可能。尤其是小动物活体成像系统,以其高灵敏度、无需放射剂等特点更是为动物模型带来了极大的发展。目前,已经建立以绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein, GFP)基因作为报告基因的膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的原位GFP肿瘤的荧光模型。但目前红色荧光蛋白(Red fluorescence protein, RFP)用于构建肿瘤模型还不多见,我们用带有红色荧光蛋白的慢病毒载体标记人膀胱癌EJ细胞,以此细胞来构建原位膀胱癌模型。采用Roper活体动物荧光成像系统在体、动态非侵入性的观察肿瘤的生长过程。膀胱癌单纯手术切除术后复发率高,最常用的方法手术切除并结合抗癌药物的膀胱灌注,丝裂霉素C (Mitomycin C, MMC)是临床上常用的膀胱癌术后化疗药物之一,MMC的作用原理是可使膀胱癌细胞的DNA解聚并阻碍DNA的复制,从而抑制肿瘤细胞分裂,达到抗肿瘤的目的。我们在成功建立膀胱癌移植瘤模型后,对裸小鼠以MMC进行膀胱灌注化疗,空白组、对照组与药物治疗组通过统计分析观察MMC灌注的疗效。第一部分慢病毒介导的红色荧光蛋白报告基因对人膀胱癌EJ细胞的标记目的：以慢病毒介导红色荧光蛋白标记膀胱癌EJ细胞,并探索标记后的EJ细胞与标记前的细胞生物学特性有无明显变化以及红色荧光蛋白基因能否在EJ细胞稳定而持久的表达。为第二部分实验中构建裸小鼠膀胱癌红色荧光裸小鼠移植瘤模型作细胞准备。方法：人膀胱癌EJ细胞常规培养、传代,分成2组,在细胞处于对数生长期、状态最佳时以不同病毒感染复数(M0I)进行RFP慢病毒(Lentivirus)对EJ细胞感染的预实验,第l组在完全培养基中直接加入病毒液感染,第2组在感染时添加聚凝胺(Polybrene),在荧光显微镜下观察细胞荧光的情况,在荧光显微镜下RFP荧光细胞记数,计算不同MOI值下细胞的感染率,获得最佳的MOI值、观察添加Polybrene对转染率有无明显提高并以最佳MOI值转染EJ细胞。获得持续性RFP阳性表达的EJ细胞(RFP/EJ)后继续培养传代到第3代后,每天进行细胞计数,连续计数8天后绘制成细胞生长曲线,划痕实验检测细胞迁徙能力。冻存细胞2个月后复苏观察荧光情况。将两种细胞分别种植于裸小鼠皮下,观察肿瘤生长情况并用动物活体荧光成像系统进行荧光观察。结果：采用RFP慢病毒(Lentivirus)成功的对EJ细胞的进行感染,添加聚凝胺(Polybrene)组在相同MOT值感染时的阳性率未明显高于未添加组的感染率；转染最佳的MOI值为20；感染后的细胞能在荧光显微镜下显示出较强的荧光,在体外可稳定表达及传代；冻存细胞2个月后复苏,细胞的转染率无明显变化；细胞生长曲线实验以及划痕试验显示,转染前后EJ细胞生长增殖速度无明显差异,转染后EJ细胞迁徙能力良好。将两种细胞分别种植于裸小鼠皮下,均可成瘤,种植RFP/RJ的裸鼠生长的皮下肿瘤在活体动物荧光成像系统下可发出红色荧光。结论：通过RFP慢病毒(Lentivirus)标记的EJ细胞,能够长时间的、稳定的在体外表达,且细胞特性与标记前无明显变化,可以用其进行下一部分建模实验。第二部分裸小鼠膀胱癌红色荧光原位移植瘤模型的建立及丝裂霉素C膀胱灌注化疗目的：以人膀胱癌EJ细胞为实验细胞、采用经腹膀胱壁下肿瘤细胞种植法和自制负压膀胱粘膜切割器经尿道切割膀胱粘膜损伤法来建立裸小鼠膀胱癌移植瘤模型；以红色荧光蛋白标记后的人膀胱癌EJ细胞为实验细胞、采用经腹膀胱壁下肿瘤细胞种植法建立裸小鼠膀胱癌红色荧光原位模型,建模成功后以丝裂霉素C膀胱灌注化疗,观察并分析治疗效果。方法：1.采用膀胱壁下细胞悬液注射法构建裸小鼠膀胱癌模型,病理切片证实膀胱癌的发生。2.以自制膀胱粘膜切割器法切割膀胱粘膜,病理切片证明能有效损伤膀胱粘膜,并在此法基础上膀胱灌注人膀胱癌EJ细胞构建裸小鼠膀胱癌模型。病理切片证实膀胱癌的发生。3.精心选取雌性裸小鼠60只,6周龄,体重18g±1.5g,随机分成空白组、对照组、药物治疗组,每组20只。空白组予生理盐水膀胱灌注,对照组、药物治疗组采用膀胱壁下细胞悬液注射法构建裸小鼠膀胱癌模型,活体动物荧光成像系统观察裸小鼠。4周后药物治疗组予丝裂霉素行膀胱灌注化疗,每周1次,每次1小时,一共进行4次。对照组4周后予生理盐水进行膀胱灌注。于第4周末、第8周末在对照组及用药组中随机抽取2只裸小鼠并处死,行膀胱病理学检查。于第9周第一天处死全部实验裸小鼠,以裸小鼠膀胱相对重量(即膀胱绝对重量与体重的比值)作为膀胱肿瘤的生长参数进行统计分析。活体动物荧光成像系统动态观察建模过程中肿瘤的变化。结果：1.以红色荧光蛋白标记后的人膀胱癌EJ细胞(RFP/EJ)成功构建膀胱癌红色荧光移植模型,膀胱壁下细胞悬液注射法建模成功率均可达到100%,自制膀胱粘膜切割器法成功率为60%。通过病理切片可证明使用自制膀胱粘膜切割器损伤膀胱粘膜并可采用此法构建膀胱癌移植瘤模型。活体动物荧光成像系统可观察到裸小鼠膀胱位置发出红色荧光。2.以膀胱相对重量作为膀胱肿瘤的生长参数,通过统计学分析,证明丝裂霉素C膀胱灌注能有效抑制裸小鼠EJ膀胱癌。结论：使用RFP/EJ建立裸小鼠红色荧光移植瘤模型以及使用活体动物荧光成像系统动态观察肿瘤生长情况是肿瘤模型研究当中的一种较新的、简便的、损伤小的方法,为肿瘤模型的研究提供了一些新的思路。丝裂霉素C作为目前临床上最为常用的膀胱癌灌注化疗药物,在裸小鼠膀胱癌的治疗当中是有效的,对丝裂霉素C的临床应用亦有一定的借鉴作用。此外,自制的膀胱粘膜切割器作为一种新型的、损伤极小的破坏裸小鼠膀胱粘膜的新方法,可以在今后的膀胱癌模型研究中推广使用。