背景:下腰痛(Low Back Pain)为现代社会中最常见疾患之一,对患者的生活造成了严重的影响。流行病学研究显示,超过80%的人在其一生中出现过一次或多次下腰痛的经历,超过15%的人疼痛程度需要住院治疗才能得到缓解。目前的病因学研究显示超过40%的下腰痛来源于椎间盘退变(Intervertebral Disc Degeneration,IDD)的继发病变。椎间盘退变是人体的一种自然衰老过程,但它可引起腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症、腰椎滑脱症等疾病。椎间盘退变是多层面、缓慢进展的过程,其中由于退变椎间盘中髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)数量减少和活性降低而导致细胞外基质合成减少是导致椎间盘退变的重要因素之一。因此,寻找减缓甚至逆转椎间盘退变的方法,一直是该领域的研究热点之一。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有自我更新及多项分化潜能的成体干细胞。近年来有研究证明,可通过干细胞移植抑制髓核细胞退变及凋亡,并有研究报道间充质干细胞可通过其分泌的外泌体(Exosome)调节NPCs中蛋白聚糖(ACAN)、Ⅱ型胶原(COL2)的表达以提高髓核细胞活性。然而干细胞获取手段多为有创,且来源有限,使其受到限制。人尿源干细胞(Urine-derived stem cells,USCs)是一种来源于尿液的干细胞,其来源广泛、取材简易、安全无创、不涉及伦理道德,是外泌体的理想来源。已有研究证明,人尿源干细胞来源性外泌体(USC-Exos)具有改善微环境、增强代谢、促进细胞再生及组织修复等能力。外泌体具有类似细胞膜的双层磷脂膜结构,并携带大量细胞来源的mRNA、mi RNA、蛋白质等,可作为细胞间信息交换的媒介,在进入靶细胞后调控靶细胞功能。课题组在前期研究中发现通过非接触式共培养USCs和NPCs,可促进NPCs增殖并提高ACAN、COL2等基因及对应蛋白的表达,因此我们通过本实验验证外泌体在这一过程中的作用。目的:基于上述内容,我们在本研究中使用了USC-Exos体外干预退变的髓核细胞,旨在探索USC-Exos体外干预下是否可促进NPCs增殖及其对髓核细胞ACAN、COL2、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)、多肿瘤抑制基因P16(P16)基因mRNA及对应蛋白的表达有何影响。方法:从健康成人尿液中获得USCs并进行体外培养,通过成骨、成软骨、成脂诱导分化及WB技术对所提取细胞进行鉴定。采用差速离心法从USCs完全培养基中提取外泌体。使用电子显微镜、粒径分析及WB技术进行外泌体的鉴定。使用USC-Exos对P6 NPCs进行干预,CCK-8法检测细胞增殖,使用PKH26荧光染料标记外泌体,并在激光共聚焦显微镜下观察NPCs对USC-Exos的摄取情况。随后进行β-半乳糖苷酶衰老染色和ACAN、COL2免疫荧光染色。用RT-PCR和WB检测NPCs中ACAN、COL2、TIMP1、P16基因mRNA及对应蛋白的表达量;将ACAN、COL2、TIMP1、P16基因的相对表达量按分组进行组间单因素方差分析,P<0.05为有统计学差异。结果:提取的USC-Exos为50～100nm的椭圆形囊泡结构,其表达CD63和Tsg101,不表达Calnexin蛋白。经PKH26标记的USC-Exos可被NPCs摄取;经USC-Exos干预后P6 NPCs增殖速度变快且衰老细胞比例降低;细胞中ACAN、COL2、TIMP1基因mRNA及对应蛋白的相对表达量在3d、5d、7d时实验组较对照组显著升高(P<0.05),P16基因mRNA及对应蛋白的相对表达量在3d、5d、7d时实验组较对照组显著降低(P<0.05)。结论:USC-Exos在体外条件下可促进退变NPCs的增殖,提高退变NPCs ACAN、COL2、TIMP1基因及对应蛋白质的表达,并降低P16基因及对应蛋白质的表达。