目的:2型糖尿病（type 2 diabetes mullitus,T₂DM）是一种伴有细胞因子增高的低度慢性炎症性疾病。到目前为止,潜在的分子机制没有完全阐明。Roux-en-Y胃旁路（Roux-en-Y gastric bypass RYGB）手术是目前治疗T₂DM有效的手术方式,术后糖尿病缓解率超过80%,但其缓解T₂DM的机制仍未明确,除了通过摄入量减少、体重减轻、增加肠道激素分泌、调节迷走神经张力等因素外,RYGB术后肠道菌群的变化是否发挥作用也日益受到关注。本研究旨在观察行RYGB手术肥胖T₂DM患者的肠道菌群变化和单核细胞表面分子表达的相关性,探讨肠道菌群的改变是否是通过单核细胞的激活导致低度慢性炎症的减缓,更好地阐明肠道菌群在肥胖T₂DM发生发展转归中的作用。方法:选取24例行RYGB手术肥胖T₂DM患者（BMI≥40kg/m²）,于RYGB术前一天和术后6个月分别抽取7mL肝素化血液和收集新鲜粪便样品。取100μL外周血分别加入10μL FITC鼠抗人CD14抗体,10μL PerCP-Cy5.5鼠抗人CD16抗体,10μL PE鼠抗人CCR₂抗体,APC鼠抗人CX₃CR₁抗体及10μL同种型对照抗体,室温避光孵育30分钟,使用FACS^TM裂解液裂解红细胞,流式细胞仪检测单核细胞表面分子CCR₂、CX₃CR₁平均荧光强度（median fluorescent intensity MFI）。取100μL外周血用50ng/mL佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯活性（PMA）,1μg/m L离子霉素和1μg/mL布雷菲德菌素A孵育4小时。使用FACS^TM裂解液裂解红细胞。然后加入10μL FITC鼠抗人CD14抗体和10μL PerCP-Cy5.5鼠抗人CD16抗体标记细胞,10μL PE鼠抗人TNF-α抗体和10μL APC鼠抗人IL-6抗体。流式细胞仪检测细胞内细胞因子（TNF-α、IL-6）。取RYGB术前、术后6个月分离的单核细胞200μL,分别加入10μL FITC-鼠抗人CD14 mAb和10μL PerCP-Cy5.5鼠抗人CD16抗体标记细胞,然后加入10μL PE-鼠抗人TLR₄和10μL PE-鼠抗人TLR₂。流式细胞仪检测单核细胞胞TLR₄和TLR₂蛋白表达阳性率和MFI。采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC）。并把PBMCs接种在24孔板中培养。将100μL等分的含有5×10⁵个细胞/mL的PBMCs悬浮液置于趋化小室的上孔中。将100ng/mL MCP-1,100ng/m L IP-10,1ng/m L RANTES和趋化因子混合物分别置于趋化小室的下孔中。经过37℃150分钟后,对下孔中的单核细胞进行定量测定,计算趋化指数。将新鲜粪便200mg用1.6mLBuffer ASL混匀后离心,过滤,在-20℃冷冻。根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书从冷冻粪便样品中提取0.05g的每个标准菌株DNA和总细菌DNA。以总细菌DNA为模板特异性PCR扩增以获取目的16SrRNA基因片段,PCR产物进行纯化,并用pMD18-T载体连接,通过测序在质粒中插入右片段,用NanoDrop 1000分光光度计测定DNA浓度。通过RT-PCR测定粪便样品中目的细菌DNA的含量。用Spearman相关分析来分析肠道菌群的变化与单核细胞中表面分子表达变化的相关性。结果:RYGB术后6个月和术前比较,单核细胞亚群分布的改变:外周血中NCM(CD14^dimCD16⁺)和IM（CD14⁺CD16⁺）的百分比均显著减少（P<0.05）,CM（CD14⁺CD16^-）的百分比显著增加（P<0.05）。RYGB术后IM（CD14⁺CD16⁺）细胞内TNF-α水平显著减少（P<0.05,）和CM（CD14⁺CD16^-）和IM（CD14⁺CD16⁺）细胞内IL-6的水平显著降低（P<0.05）。此外,CM（CD14⁺CD16^-）和IM（CD14⁺CD16⁺）表面的脂多糖（lipopolysaccharide LPS）受体TLR₄的表达显著下降（P<0.05）,肽聚糖和脂肽的受体TLR₂的表达差异无统计学意义（P>0.05）。单核细胞迁移能力评估:RYGB术后IM（CD14⁺CD16⁺）中趋化因子受体CCR₂表达（P<0.05）和三个单核细胞亚群中趋化因子受体CX₃CR₁表达均显著降低（P<0.05）,单核细胞趋化因子MCP-1,RANTES和趋化因子混合物趋化指数减少（P<0.05）,RYGB术后单核细胞迁移能力明显降低。RYGB术后肠道菌群的变化:拟杆菌门丰度显著增加（P<0.05）,双歧杆菌数量显著增加（P<0.05）。而大肠杆菌的数量显著减少（P<0.05）。肠道菌群与单核细胞亚群之间的相关性分析:拟杆菌增加与NCM百分率的减少呈负相关（r=-0.477P<0.05）;双歧杆菌增加与IM中CCR₂表达减少呈负相关（r=-0.5817 P<0.05）和CX₃CR₁表达的减少呈负相关（r=-0.478 P<0.05）;大肠杆菌的数量减少与IM单核细胞内TNF-α减少表达呈正相关（r=0.442 P<0.05）;大肠杆菌的数量减少与IM表面LPS受体TLR₄减少呈正相关（r=0.425 P<0.05）。结论:RYGB手术影响了单核细胞的表型,减少单核细胞内的炎症因子;RYGB术后随着单核细胞表型的改变,单核细胞亚群促炎细胞因子的功能和单核细胞迁移能力也明显减弱;RYGB术后肠道菌群发生明显变化,主要是双歧杆菌、拟杆菌增加,大肠杆菌减少。Spearman等级相关系数分析显示肠道菌群的变化与单核细胞中表面分子表达变化密切相关。本研究首次阐明了RYGB术后肠道菌群的改变影响了单核细胞的表型和生物学功能,改善了代谢性内毒素血症,这可能有助于肥胖T₂DM的低度慢性炎症减缓。