论文部分内容阅读
前言 脑缺血再灌注损伤时神经细胞死亡除坏死外，还存在另一种形式——细胞凋亡，且在缺血再灌注损伤中起着重要的作用。细胞凋亡是受基因调控的一种细胞死亡，而bcl-2基因是主要的抗细胞凋亡基因，将bcl-2基因转入脑，使其在细胞组织中表达增加，可减少或抑制神经细胞凋亡的发生，具神经保护作用。同时，白细胞与内皮细胞的粘聚在缺血再灌注损害中起关键作用，而ICAM-1是增强白细胞和内皮细胞间粘附作用的关键介质，脑缺血时ICAM-1表达明显上调，使白细胞和内皮细胞间粘附力增加，进而导致脑组织再灌注损伤。这提示我们增加bcl-2的表达，降低ICAM-1的表达将有助于减轻再灌注损伤。本研究采用大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，经侧脑室注射质粒pLXSN介导人bcl-2 cDNA后，观察脑梗死体积、bcl-2及ICAM-1表达的同时，证实bcl-2的神经保护作用，探讨bcl-2与ICAM-1之间的关系。 材料与方法 健康Wistar大鼠135只，体重250-300g，按随机排列表随机分为三组：生理盐水组、空质粒组和bcl-2组，每组45只，每组在缺血2小时再灌注3、6、24、48、72小时5个时间点又随机分为5个亚组，每亚组9只。采用改良线栓法制备右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，然后立即将大鼠固定在脑立体定位仪上，应用立体定向技术向侧脑室内分别注射生理盐水、质粒pLXSN及pLXSN-bcl-2，MCAO制备成功的大鼠于缺血后2小时进行再灌注。每亚组各取5只大鼠，分别于相应的缺血再灌注时间点(3h、6h、24h、48h、72h)直接断头取脑，采用TTC染色，应用显微图象分析系统采集并分析脑梗死面积，按梯形法计算脑梗死体积。每亚组各取4只大鼠分别于相应的缺血再灌注后3、6、24、48、72h灌注取脑，常规固定，石蜡包埋，制成石蜡切片后，采用免疫组织化学方法分别进行bcl-2和ICAM-1免疫组化染色，应用显微图象分析系统采集并分析图象，观察bcl-2及ICAM-1的表达。各组数据以均数土标准差表示，组间差异分析方法采用t检验，p<0.05认为有统计学意义。实验结果 1.梗死体积测定:生理盐水组和空质粒组对比，各时间点均无显著差异(p>0.05)。bcl一组与空质粒组对比，3小时及6小时未见显著差异(分别为3h:54.89士1 .06 Vs 56.25土1 .69，6h:134.82土54.92 Vs 134.82土20.78，p>0.05);24、48和72小时bel一2组梗死体积明显缩小(分别为24h:89.19士1 1 .87 Vs 234.27士10.01，48h: 131.41士12.02 Vs 212.12土21.78，72h:70.64士9.21 Vs133.71士20.13，p<0.05)。 2.bd一2蛋白表达:生理盐水组和空质粒组相比，在梗死后各时间点的表达均未见显著差异(p>0.05)。bcl一组与空质粒组相比，bcl一表达在梗死后各时间点均显著增加(分别为3h:98 .07士1 .68 Vs 85.26*1.67，6h:101 .14士3.84 Vs 87.83土 2.13，24h:97.18士2.23 Vs 85.98士1.02，48h:100.63士3.21 Vs 88.73土0.96，72h:99.45士2.12 Vs 87.31土0.89，P<0 .05)。 3.ICAM一1蛋白表达:生理盐水组和空质粒组相比，各时间点的表达均未见显著差异(p>0.05)。与空质粒组相比，bcl一2组3小时ICAM一1的表达无明显差异(87 .22士3 .86 Vs 89 .95士2.26，p>0.05)，6、24、48、72小时ICAM一l表达均显著减少(分别为6h:75.88土1.26 Vs 90.06士2.44，24h:73 .75土1 .48 Vs 89.62土2.08，48h:72.76土2.88 Vs 89.25士2.17，72h:76.41士1 .90 Vs 91 .54士1 .42，p<0.05)。讨论 已有研究证实，脑缺血再灌注后神经元死亡的主要形式是细胞凋亡，而bcl一2基因是重要的抗细胞凋亡基因，bcl一表达于有缺血损伤且能够存活的细胞，通过基因敲除、转基因动物和基因转染等实验发现其有明显的抑制凋亡作用和神经保护作用。但是，以往的研究多采用转基因动物的方式或以病毒作为转基因载体，因为二者均具有致畸致癌的危险，故限制了其临床应用。本实验利用pLXSN作载体，将bcl一2基因经侧脑室注射导人大鼠脑内，结果显示:生理盐水组与空质粒组对比，各时间点各项指标观察均无显著差异，这说明质粒载体的安全性。而bcl佗组与空质粒组或生理盐水组对比，bd一组中bcl一蛋白表达明显增多，梗死体积显著缩小，这说明将pLx-SN介导的bcl一基因经侧脑室注射人脑可以增加bcl一表达，缩小梗死灶，从而减轻缺血再灌注引起的损害。 大量研究显示:白细胞与血管内皮细胞间的粘附是脑缺血及其再灌注损伤的主要机制，在这一过程中，ICAM一1起到关键性作用。ICAM一1在体内分布较广，但在血管内皮细胞表达最强。正常情况下，血管内皮细胞表面仅有少量ICAM一1表达，而在缺血再灌注时ICAM一1表达明显上调;ICAM一l基因敲除及ICAM一1单克隆抗体的应用均能使梗死灶体积明显缩小。这说明ICAM一1是介导缺血再灌注损伤的关键因子，抑制其异常表达，可以有效地阻断白细胞和血管内皮细胞间的粘附过程，从而减轻再灌注损伤程度。 ICAM一1的表达是可以诱导的，在局灶性脑缺血和再灌注期间lL一1的合成和释放增加，而ICAM一1可被IL一1诱导表达。同时，bcl一2的表达可在一定程度上抑制IL一1的表达或活性。故可推测