融合性红细胞载体转移生物大分子的研究

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生物大分子的递送涉及到入胞、内涵体逃逸、跨越、入核屏障和整个过程中生物活性的维持。目前的生物大分子投递系统,包括磷酸钙沉淀、多聚阳离子化合物、阳离子脂质体、和病毒载体,各自存在不同的缺陷。血影细胞由于其优越的组织相容性和可操作性,因而被广泛地运用于装载抗癌药物与酶蛋白。但高效装载大分子核酸及与靶细胞相融合是两个仍未解决的关键问题。  本研究的思路是:利用水泡性口炎病毒糖蛋白G(VSV-G)的膜融合能力,促进血影细胞的投送能力;利用多种试剂预先浓缩DN A,促进血影细胞包被大分子核酸的能力。  本研究所获结果如下:  利用pLP-VSVG质粒转染Ad293细胞,48小时后,收集条件培养液和细胞。Western blot结果显示VSV-G可以在条件培养液及细胞裂解液中检测到。将重组酶质粒(pCAG-CreER)与报告质粒(pCMV-DsRed/loxP2-EGFP)分别转染Ad293细胞,24小时后收集细胞并进行共培养,同时添加VSV-G与ta mo xife n,结果发现约14.5%的细胞发生重组,表明所获VSV-G具备膜融合能力。将所获VSV-G蛋白与小鼠红细胞膜于37?C孵育1小时,结果发现,VSV-G可以自发整合到细胞膜上,且与对称性红细胞膜的结合效率更高。  采用低渗裂解法、透析法和冻融法装载FITC-Dextran。激光共聚焦结果显示,三种方法皆能高效包被FITC-Dextran,但冻融易于造成细胞膜破裂。对于低渗裂解法,在溶血发生的同时装载,包装效率较高,且裂解液中二价阳离子(Ca2+、Mg2+)的种类对装载效率无显著影响。整合VSV-G后,将装载F ITC-De xtra n的血影细胞与靶细胞孵育,3小时后即可观察到胞内荧光信号,随时间延长,靶细胞内的荧光信号增强。  采用低渗裂解法装载辣根过氧化物酶(HRP)并进行蛋白的投递。结果显示,转移的HRP可在靶细胞内稳定存在10小时,但随时间延长逐渐降解。利用透析法包装重组酶CreER的细胞裂解液,整合VSV-G后,将血影细胞与转染了报告质粒的靶细胞孵育,发现有荧光绿色细胞出现,说明转移的 CreER蛋白具有活性。  采用低渗裂解法装载pGL3-Control质粒并进行DNA的投递,未发现产生明显荧光素酶活性;若用PEG6000和PEI2000预浓缩 DNA,则可以明确检测到荧光素酶活性,且PEI2000的效果比PEG6000的更为显著。然而,二者的绝对值都很低,提示DNA包装的效率低下。若用PolyFect预浓缩pGL3-Control质粒,则可以获得比PEI2000和PEG6000浓缩高出100倍的荧光素酶读数,提示DNA因PolyFect的强正电性可以很好地结合于血影细胞膜外。  综上所述,本研究利用VSV-G蛋白提高了血影细胞的投递能力,利用PEG6000和PEI2000预浓在有限程度上提高了核酸的装载能力。相反,利用PolyFect预浓缩,则有效地促进DN A吸附于血影细胞表面。本课题的研究为生物大分子投递提供新的策略,对疾病的分子治疗具有一定的意义。
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