血吸虫病(schistosomiasis)是由血吸虫(schistosome)感染引起的一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病，主要流行于亚洲、非洲、拉丁美洲的76个国家和地区。我国主要流行日本血吸虫病，至今已有2100年历史。据2006年全国疫情调查资料显示，我国大部分流行地区已消灭或控制了血吸虫病，但尚有105个血吸虫病流行县(市、区)，约67万感染者，且近年来疫情有所回升，并伴随出现向城市蔓延的趋势，因此。血吸虫病防治仍然是我国重要的公共卫生问题之一。 目前国内外防治血吸虫病的主要措施是采取人畜同步化疗、易感地带灭螺等相结合的综合性防治方法，但由于现有的以吡喹酮为主要药物的化疗不能有效防治治疗后再感染，且存在低敏感虫株及潜在药物耐药性的威胁，使得血吸虫病的有效防治受到阻碍。上世纪80年代，研究者们确立了以发展血吸虫病疫苗作为防治血吸虫病的研究重点，使药物化疗的短效作用与疫苗接种的长效免疫预防作用相结合，不仅能有效减少疾病的总体发病率，也能避免单纯化疗后的重复感染。 抗血吸虫病疫苗的研究历经了死疫苗、减毒活疫苗、基因工程蛋白疫苗及核酸疫苗几个阶段，目前主要集中在特异性重组蛋白疫苗及核酸疫苗方向，通过模拟宿主自然感染后产生的保护性机理，以具有保护能力的抗血清或单抗筛选虫体cDNA文库来寻找特异的保护性相关抗原。然而，近30年来的实验研究已证明，这种单纯以刺激Th1或Th2型体液免疫应答为主的特异性抗原分子疫苗并不能稳定地诱导动物模型高效的保护性免疫力。致弱尾蚴疫苗的研究始于上世纪60年代末。大量实验证明，经辐照致弱的侵袭性曼氏血吸虫或日本血吸虫尾蚴能稳定诱导实验动物产生高达90％的保护性免疫力，是目前公认的最高效、稳定的抗血吸虫病疫苗。对曼氏血吸虫致弱尾蚴疫苗的进一步研究发现，这种保护性免疫力主要是由获得性免疫机制介导的，由Th1型优势细胞免疫应答向Th2型优势体液免疫应答发展的持续性免疫应答过程。致弱尾蚴在入侵皮肤处刺激天然免疫系统细胞的应答，释放或分泌的大量虫体抗原可直接促进天然免疫细胞分泌产生Th1型细胞因子及趋化因子，或者被递呈给皮肤引流淋巴结，刺激Th1表型T细胞大量增殖活化而激发获得性免疫应答。虽然后续Th2型优势体液免疫应答的诱导机制不是很清楚，但其与高效的保护性免疫力水平是直接相关的。 辐照致弱尾蚴疫苗已被证实是目前疫苗研究开发的最理想模拟模型，而目前对其研究主要集中在免疫宿主的免疫效应分子机制方面，有关保护性特异抗原分子的寻找也局限在使用保护性血清进行免疫沉淀、Western blot及筛选虫体cDNA文库等方法。由于辐照射线具有较高能量，可能破坏或损伤虫体DNA结构而影响mRNA的转录和翻译，最终引起相关蛋白质表达水平或结构的变化。这些差异表达的蛋白质可能与正常非照射尾蚴分泌或脱落的蛋白有所不同，可能是致弱尾蚴诱导高水平保护性免疫力的分子基础。因此，对致弱尾蚴虫体总蛋白质水平变化的认识能为深入探索高效的保护性免疫机制及疫苗的研究提供扎实的实验依据。 研究目的： 本研究旨在对紫外线辐照致弱日本血吸虫尾蚴的可溶性虫体总蛋白质表达谱及差异表达蛋白进行分析与鉴定，拟为揭示致弱尾蚴诱导产生高水平保护性免疫力的效应机制的可能分子基础提供在虫体蛋白质水平上的全面认识，另一方面也为模拟这一机制以研制抗血吸虫病疫苗提供新的思路和有效的疫苗候选分子。 研究方法： 研究方法主要包括采用双向电泳技术对紫外线辐照致弱尾蚴(UVAC)及正常尾蚴(NC)的可溶性虫体总蛋白质谱进行比较与分析，对差异表达蛋白进行MALDI—TOF—MS质谱鉴定，并采用实时荧光定量PCR对其中4个表达上调的差异表达蛋白在mRNA转录水平上的变化及与紫外线辐照剂量及作用时间的效应关系进行探讨。此外，对这4个表达上调的蛋白进行基因克隆及重组蛋白的原核表达与鉴定，并采用ELISA、Western blot及淋巴细胞增殖试验等对重组蛋白的抗原性、免疫原性及免疫细胞刺激效应等功能进行检测。 研究结果： 1.正常尾蚴与紫外线辐照致弱尾蚴可溶性虫体总蛋白的双向电泳分离经双向电泳(pH3-10，20 cm×24 cm×0.1 cm)的分离及银染，获得NC及UVAC可溶性虫体总蛋白质图谱，分别于图谱上获得1458±29及1379±45个蛋白斑点，绝大部分蛋白点分布于分子量20kDa～97kDa、等电点4～8之间。 2.紫外线辐照致弱尾蚴可溶性差异表达蛋白的鉴定 比较NC与UVAC两组样本图谱间斑点相对体积的差异，选取差异比值大于1.5的71个斑点作为差异表达蛋白候选斑点。15个蛋白斑点在UVAC组表达上调，其中有5个为在UVAC组中特异性表达；56个蛋白斑点在UVAC组表达下调，其中有8个在UVAC组中未见表达。使用MALDI—TOF—MS成功鉴定出其中20个斑点，4个在UVAC组中表达上调，其中1个为在UVAC组中特异性表达；16个在UVAC组中表达下调，其中2个在UVAC组中未见表达。据功能可将这些差异表达蛋白大致分为5类，分别为：细胞骨架与结构相关蛋白、能量代谢相关蛋白、转录/翻译与信号转导/调控相关蛋白、热休克家族相关蛋白及其他功能蛋白如20S蛋白酶体等。 3.差异表达蛋白mRNA转录水平与紫外线辐照剂量及作用时间的效应关系 采用实时荧光定量PCR对4个表达上调差异表达蛋白SjActin、SjADH、SjHSP70、Sjβ—Tubulin的编码基因在mRNA转录水平的变化进行定量分析，并对这种变化与紫外线辐照剂量及作用时间的关系进行探讨。结果显示在300μW/cm2及400μW/cm2较高UV剂量处理下4个基因的mRNA转录水平均表现为上调，而在100μW/cm2及200μW/cm2低UV剂量处理下转录水平变化不明显。辐照后1d即可出现基因转录水平的改变，而随培养时间的延长，转录水平的变化呈现恢复的趋势。 4.差异表达蛋白全长编码基因的扩增、克隆及表达 根据NCBI GenBank中日本血吸虫SjActin、SjADH、SjHSP70、Sjβ—Tubulin基因序列，设计特异性引物从尾蚴cDNA噬菌体文库中扩增各基因的全长编码序列，并定向克隆入原核表达质粒pET28a(+)或pET30a(+)中，经PCR、双酶切及测序鉴定克隆成功。将成功构建的重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行重组融合蛋白原核表达，经His—tag亲和层析柱纯化获得高纯度的重组融合表达蛋白(rSjActin、rSjADH、rSjHSP70、rSjβ—Tubulin)，并经质谱鉴定证实。 5.差异表达重组蛋白的免疫学功能研究 将纯化后rSjActin、rSjADH、rSjHSP70、rSjβ—Tubulin分别免疫Balb/c小鼠，获得高效价特异性免疫血清。ELISA及Western blot检测显示这4种重组蛋白均具有良好的免疫原性及免疫反应性。小鼠致敏脾淋巴细胞增殖试验显示4个重组融合蛋白对UVAC免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖均具有一定的刺激作用。 讨论与小结： 本研究应用蛋白质组学技术，对紫外线辐照致弱日本血吸虫尾蚴差异表达的可溶性虫体蛋白进行分析与鉴定，发现辐照后虫体总蛋白表达量下降，且一些细胞骨架与结构相关蛋白、能量代谢相关蛋白、转录/翻译与信号转导/调控相关蛋白、热休克家族相关蛋白及其他功能蛋白如20S蛋白酶体等5类功能蛋白分子表达发生变化；此外还发现这种变化在高剂量辐照处理后1d即发生，并随着培养时间的延长而呈现恢复趋势，表明辐照对虫体的影响具有一定的时效性。其中表达上调的4个蛋白分子经克隆、表达获得的重组融合蛋白具有良好的免疫原性及免疫反应性，并对紫外线辐照致弱尾蚴免疫小鼠脾淋巴细胞增殖具有一定的刺激作用。 本研究在国际上首次应用蛋白质组学技术对紫外线辐照致弱尾蚴的虫体可溶性蛋白质组表达谱进行研究，其研究结果为揭示致弱尾蚴诱导高水平保护性免疫力效应机理产生的可能分子基础提供了在虫体蛋白质水平上的实验数据，另一方面也为模拟这一机制研制血吸虫病疫苗提供了新的思路和有研究价值的候选分子。