【摘 要】
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在我国,乳腺癌作为一种最常见的女性癌症,一直威胁女性健康并呈逐年上升趋势。尽管最近在乳腺癌治疗方面取得了进展,包括化疗、内分泌治疗和HER2靶向治疗,但乳腺癌细胞的高增殖性、侵袭性、转移性潜力以及耐药性,一直是乳腺癌患者治疗失败和生存率低的主要原因。根据已有的研究表明,发现KLF家族成员参与乳腺癌发生发展并起到关键作用。KLF9（锌指转录因子）同多种类型癌症的发生和不良预后密切相关。有数据表明,K
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在我国,乳腺癌作为一种最常见的女性癌症,一直威胁女性健康并呈逐年上升趋势。尽管最近在乳腺癌治疗方面取得了进展,包括化疗、内分泌治疗和HER2靶向治疗,但乳腺癌细胞的高增殖性、侵袭性、转移性潜力以及耐药性,一直是乳腺癌患者治疗失败和生存率低的主要原因。根据已有的研究表明,发现KLF家族成员参与乳腺癌发生发展并起到关键作用。KLF9（锌指转录因子）同多种类型癌症的发生和不良预后密切相关。有数据表明,KLF9发挥抑癌功效,但在乳腺癌中的表达低于正常组织,影响其功能的发挥。去泛素化酶USP7可以通过对底物的调节参与乳腺癌的进展,通过前期的免疫印迹实验发现USP7可以显著提高KLF9的蛋白水平,并确定了CCND1（促增殖基因）可以作为KLF9下游调控的一个靶基因。因此本研究主要探索USP7/KLF9/CCND1轴与乳腺癌细胞增殖的调控机制,为乳腺癌患者针对CCND1的药物开发提供理论基础。本课题主要内容如下:（1）通过蛋白免疫印迹实验发现USP7能够明显上调KLF9的蛋白水平;（2）CO-IP和GST-Pull down实验确定二者外源的直接、间接互作;（3）免疫荧光实验发现USP7和KLF9共定位在细胞核内,为二者互作提供空间支持;（4）通过蛋白免疫印迹实验,过表达USP7能够明显延长KLF9的半衰期,反之,敲低USP7结果相反。此外,当用MG132抑制泛素-蛋白酶体途径时,有效地阻止了与U SP7消耗引起的KLF9蛋白减少。（5）外源去泛素化实验发现,USP7能够通过去泛素化提高KLF9的稳定性;（6）RT-PCR和免疫印迹实验证明了KLF9能同时下调CCND1的m RNA和Cyclin D1蛋白水平。荧光素酶报告基因实验证明KLF9可以抑制CCND1的启动子活性,进而下调其转录和翻译水平。并且KLF9主要通过其DNA结合结构域（DBD）抑制CCND1启动子活性;（7）通过MTT、克隆形成实验研究发现USP7/KLF9/CCND1轴对乳腺癌细胞增殖的抑制作用。综上所述,本课题主要研究USP7通过去泛素化KLF9提高其蛋白稳定性,负调控C CND1的转录水平,抑制乳腺癌细胞的增殖。为治疗乳腺癌的难题和开发针对CCND1的药物提供新的思路。
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