研究背景：原发性肝癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤。流行病学调查发现原发性肝癌与HBV、HCV慢性感染密切相关。我国是病毒性肝炎的高发区，目前已有超过一亿的HBV和HCV的感染者，因而导致肝癌的发病率居高不下。据卫生部统计，原发性肝癌是所有肿瘤中的第二位致死因素，在城市中仅次于肺癌，在农村中仅次于胃癌。因此研究肝癌的治疗刻不容缓。目前主要用外科手术，化学治疗，放射治疗和生物治疗四种方式。近年来，随着肝癌的发病机理和治疗研究的进展，人们认识到细胞凋亡机制的异常在肝癌发生和抗肿瘤治疗中起重要作用。现有的研究提示很多抗肿瘤治疗是诱导肿瘤细胞的凋亡起作用。 肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是Ⅱ型跨膜蛋白，是最近发现的能诱导多种转化细胞凋亡的TNF家族成员。在3个死亡配体中，TNF，FasL和TRAIL中，TRAIL能有效地诱导细胞凋亡，与TNF和FasL不同的是，仅诱导转化细胞、肿瘤细胞和某些病毒感染细胞发生凋亡，而对正常细胞无明显的杀伤作用。这一特性预示着其在治疗病毒感染以及肿瘤患者中有广泛的应用前景。但是，最近研究发现人重组LZ-TRAIL在体外能诱导人正常肝细胞凋亡。TRAIL对肝细胞严重的毒性作用，使它的肿瘤治疗作用受到了限制。研究也发现，许多病毒可引起感染细胞发生凋亡，如人免疫缺陷病毒，麻疹病毒、流感病毒等RNA病毒；而某些DNA病毒，包括疱疹病毒、腺病毒、人乳头瘤病毒等则抑制感染细胞凋亡。 目的：探讨重组人TRAIL蛋白及其联合化疗药物的抗肝癌效应，Caspase-9抑制剂(Z-LEHD-FMK)对正常肝细胞的保护作用，HBV感染对TRAIL诱导细胞凋亡的影响。 实验方法：1)细胞杀伤率分析，将细胞2×10~4(100μl)/孔培养于96孔板，加含有10％ 浙江大学硕士学位论文 胎牛血清的培养液至100 VI培养12小时后，吸去上清后加100 VI的无血清培养液培养12 小时后加不同浓度的 TRAIL（50ng／ml，二00ng／ml，200ng／ml，400ng／ml，800ng／ml，1600ng／gi）及 其选择合适的剂量与亚毒性剂量的化疗药（阿霉素0．l时ml，丝裂霉素 收／ml及5－F［］ 0．led／。l）联合应用，Caspaseop抑制剂（20M）和拉米夫定0．2阶1，用无血清的培养液加 至1加VI，培养＊小时后加入20N的加叮，与m门共孵育4小时后0．仍70U检测。酶标仪 上测出 0．D570nm值，细胞杀伤率二［（卜实验组光吸收值／对照组光吸收值）］X 100，重复三次， 得出量效关系曲线。2）凋亡分析：使用CALTA Laboratories公司Annexin V试剂盒检测。 Znl培养液含有 4 X 10s细胞培养于 12孔板，加含有 10％胎牛血清的培养液至 100 ul培养 12 小时后，吸去培养液加 100ul 的无血清 1640培养液培养12 小时后加不同浓度TRAIL （0，50ng／ml，100ng／ml，200ng／ml，400ng／ml，800ng／ml，1600nyml）及其选择合适的剂量与亚 毒性剂量的化疗药（阿霉素0．IN／ml，丝裂霉素收／ml及SFU 0，lug／ml）联合应用，用无 血清的培养液加至 Zml，12 ，J’时后，采用流式细胞仪（Fib）AnnexinV－FI冗和碘化丙吱（PI） 荧光染色分析其诱导凋亡活性，碘化丙陡（PI）和nnexinV均阴性为活细胞，PI阴性，Annexin V阳性为早期凋亡细胞，碘化丙晖（PI）和AnnexinV均阳性为晚期凋亡细胞。3）药物抑制 实验：IX 10’／。IHepGZ．2．15细胞接种 24孔细胞培养板，每孔 lml，37C、sgn饱和湿度的 条件下培养24h，加入0．Zng／l拉米夫定，同时设细胞对照，每24h换原浓度药液及对照培养 液一次，3d后收集培养液，－20C冰冻保存待测。4）抗原抑制实验：用HBeAg和HBsAs固相 放射免疫检测试剂盒测定HBeAs和HBsAs的滴度。测定每孔cnm值，三个平行孔取均值后，计 算抑制率。抗原抑制率（％）＝【（细胞对照 cp。值－给药组叩m值）／细胞对照叩m值IX 100。 5）HBV DNA检测：加入拉米夫定及对照的HenGZ．2．15细胞的上清液经深圳匹基公司 HBV DM 荧光定量试剂盒抽提后，用Roche公司的Lightcycle荧光定量仪检测DNA的拷贝数。 6）统计分析：细胞活性分析采用非线性模型，卡方检验得出 P值，所有实验结果均采用 SPSS 10．0统计软件，进行统计分析。 结果：1）TRAIL诱导细胞株的凋亡：人重组 TRAIL对肝癌细胞株及人正常肝细胞 L02 杀伤的量－效关系成正比，TRAIL100ng·ml”’杀伤率约foe，1600ng·ml－’杀伤率为55＄以上。 而转染HBV的HePGZ．2．15细胞，加人不同浓度的TRAIL后，杀伤率维持在foe左右，而肝癌 细胞HepGZ在不同浓度的 TRAIL的作用下，TRAIL200ng／ml可见凋亡峰，凋亡率为 18．83＄，随 着 TRAIL浓度的增加凋亡率也增加，TRAIL 1600ng／ml，凋亡率达 6Ch。2）TRAIL联合亚毒性