论文部分内容阅读
钙网蛋白（Calreticulin, CRT）是一种普遍存在于高等生物除红细胞之外所有细胞中的极其保守的内质网钙结合蛋白,具有多种生物学功能,在调节钙平衡,协助蛋白质的折叠和加工等方面都发挥着重要的作用,由于该蛋白具有非常保守的基因组成和氨基酸序列,因此它在维持细胞功能方面具有重要作用,目前,该蛋白在许多动物和植物中已经进行了研究。热激蛋白（Heat Stress Proteins, HSPs）也叫做热休克蛋白（Heat Shock Proteins, HSPs）,是机体受到外界的一系列刺激而产生的一类蛋白质。当然,正常生理条件下的细胞中也有HSPs的存在,这种HSPs称为热休克同源蛋白（Heat Shock Cognate Proteins, HSCs）。HSP70家族是HSPs超家族里最保守且研究最为广泛的一个家族,其中HSC70就是HSP70家族的成员之一,这类蛋白在正常情况下表达,应激后也会诱导其表达,对细胞的分化、发育起着很重要的作用。拟黑多刺蚁（Polyrhachis Vicina Roger）是一种行为复杂的昆虫,群居式生活,群体内部有明显的品级分化,并且具有药用价值,因此,选用拟黑多刺蚁为实验材料来研究昆虫的生长发育具有一定的经济意义。本论文的实验材料为拟黑多刺蚁,通过RT-PCR和RACE技术成功获得了CRT基因和HSC70基因的全长cDNA序列,并应用相关的生物信息学软件对其蛋白质序列和基因序列进行了分析,另外,通过荧光实时定量PCR技术对不同品级和不同发育阶段虫体的mRNA进行了定量的研究。研究结果如下：1.拟黑多刺蚁CRT基因的全长cDNA为1584bp。其中,开放阅读框（open reading frame, ORF）为1251bp,编码416个氨基酸残基,5’非编码区（5’-UTR）的长度是87bp,3’非编码区（3’-UTR）的长度是246bp,将其命名为PvCRT,同时,将该基因的全长cDNA序列已成功上传到美国国立生物技术信息中心（NCBI）的GenBank上,获得的序列号为JQ783054。2.运用生物信息学方法对PvCRT的蛋白序列进行了分析。同源性分析表明：PvCRT编码的蛋白与其它昆虫的CRT蛋白具有较高的相似性,与丽蝇蛹集金小蜂、小菜蛾和果蝇的相似度分别为：99%、88%和89%,这与CRT是高度保守的蛋白相一致。一级结构分析表明：PvCRT编码的蛋白的分子量为48.5kDa,理论等电点为4.37。该蛋白的功能基序分析表明：该蛋白有多个功能位点,另外,PvCRT编码的最后四个氨基酸序列为内质网滞留信号HDEL,这与相关报道中该基因的定位是一致的,进而验证了克隆出来的序列就是拟黑多刺蚁CRT基因的cDNA序列。二级结构预测表明：该蛋白是混合型蛋白,三级结构预测表明：与该蛋白最匹配的模板是cljhnA。3.通过使用荧光实时定量PCR技术,对拟黑多刺蚁不同品级和不同发育阶段虫体的mRNA进行定量研究,结果显示：PvCRT基因在拟黑多刺蚁的不同品级和各个时期中均有表达,但是mRNA的表达水平各不相同。发育时期,卵的表达量最低,一龄幼虫的表达量开始升高,但是二龄幼虫的表达量又下降,到了三龄幼虫时期表达量达到最高,而四龄幼虫的表达量又下降,蛹期的表达量又升高；成虫时期,工蚁的表达量最高,这可能与工蚁复杂的行为活动有关,而雄蚁的表达量最低。由此可以看出,PvCRT基因在拟黑多刺蚁的生长发育过程中起着很重要的作用。4.拟黑多刺蚁HSC70基因的全长cDNA为2171bp,其中,ORF为1968bp,编码655个氨基酸残基,5’-UTR的长度是90bp,3’-UTR的长度是113bp,将其命名为PvHSC70,同时也将其cDNA序列上传到NCBI的GenBank上,获得的序列号为：KC184398。5.运用生物信息学方法对PvHSC70的蛋白序列进行了分析。同源性分析表明：PvHSC70编码的蛋白与其它昆虫HSC70蛋白的同源性很高,相似度都在85%以上,尤其是与膜翅目昆虫的同源性,与丽蝇蛹集金小蜂、小菜蛾、亚洲玉米螟的相似度分别为：93%、90%和90%。一级结构分析表明：PvHSC70编码的蛋白的分子量为71.4kDa,理论等电点为5.43。另外,该蛋白的功能基序分析表明：该蛋白存在多个功能位点,PvHSC70编码的最后四个氨基酸序列为EEVD,这是胞质型HSP70保守的基序,从而验证了该基因是HSP70家族的成员之一,进而验证了克隆出来的序列就是拟黑多刺蚁HSC70基因的cDNA序列。二级结构预测表明：该蛋白是混合型蛋白,三级结构预测表明：与该蛋白最匹配的模板为c3d2fC。6.荧光实时定量PCR技术的研究结果表明：PvHSC70基因在拟黑多刺蚁的不同品级和不同发育时期中都有表达,但是mRNA的表达水平有差异。卵和幼虫时期的表达量都很高,但是到了成虫以后,其表达量整体低于幼虫时期,在成虫中,雄蚁中的表达量最高,这可能与雄蚁的婚飞有关,不过目前还没有相关报道,因此,该基因在雄蚁中的功能还有待进一步的研究。本研究首次从拟黑多刺蚁体内成功克隆出了CRT和HSC70两个基因的全长cDNA,并上传至NCBI的GenBank上,获得了相应的序列号。同时,采用了生物信息学软件对它们的蛋白质序列进行了预测和分析,其结果与其它昆虫该基因的细胞定位和结构等是相互吻合的,进一步验证了克隆所获得的这两个cDNA序列就是CRT和HSC70基因的序列。另外,实时定量的结果表明：这两个基因的mRNA水平在拟黑多刺蚁的不同品级和不同发育时期中均有表达,但是表达量各不相同,这就为进一步探讨这两个基因的生物学功能提供数据依据。