听力障碍是影响公众身体健康和生活质量的重要因素,数以亿计的人受到威胁。世界卫生组织2013年2月27日在日内瓦表示,全世界有3.6亿人患有耳聋或听力障碍,占全球人口的5%,其中三分之二在发展中国家。中国是世界上最大的发展中国家,有13亿人口,听力障碍残疾人有2057万,占全国人口的16.79%o,绝大部分为感音神经性聋。感音神经性聋的病理改变主要是毛细胞损伤、螺旋神经节、支持细胞及神经末梢的器质性改变,发病原因公认有缺血、病毒感染、耳毒性药物中毒及老年性退行性变等,尤其缺血因素最为常见。而血流障碍中只有少数为单纯的缺血损伤,大部分是缺血后的再灌注损伤。例如突发性耳聋,目前多认为是内耳微循环障碍所致的感音神经性聋。有研究指出缺血后再灌注造成的损伤大于单纯缺血造成的损伤。所以探讨内耳缺血／再灌注损伤(I/RI)的机制将非常有利于内耳疾病的研究。盐酸椒苯酮胺(piperphentonamine hydrochloride,简称椒苯酮胺,PPTA)是由中国医学科学院药物研究所合成筛选出的化学创新药。相关研究表明椒苯酮胺对缺血再灌注损伤的心肌具有保护作用,是钙增敏剂类强心药及心肌保护剂。另外有研究表明其对缺血再灌注损伤脑组织也有保护作用,但国内外尚无椒苯酮胺抗内耳缺血再灌注损伤作用的研究。本实验从听觉功能、细胞形态、炎性因子及细胞凋亡四个方面对豚鼠耳蜗的(I/RI)进行研究,旨在探讨椒苯酮胺对内耳(I/RI)的保护作用及可能机制,为椒苯酮胺用于缺血性内耳疾病的治疗提供药理学依据。本研究分为四个部分：第一部分耳蜗缺血/再灌注(I/R)豚鼠模型的建立目的建立豚鼠耳蜗缺血/再灌注损伤模型,探讨豚鼠耳蜗缺血/再灌注损伤后听功能改变。方法将24只健康、耳廓反射灵敏,体重200-250g豚鼠随机分成3组,分别为正常组、空白对照组、缺血再灌注组。缺血再灌注模型通过暂时性微动脉夹夹闭双侧椎动脉、结扎线活结结扎右侧颈总动脉,实验中激光多普勒检测耳蜗血流(CoBF)。各组动物分别于手术前、缺血再灌注6h、24h、48h行听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)测定,观察ABR各波潜伏期、Ⅰ—Ⅲ波间期和Ⅲ波阈值。结果正常组、假手术组术前、术后ABR阈值无显著变化;缺血再灌注组再灌注6小时、24小时后ABR闽值显著升高(P<0.05),24小时达到高峰,48小时ABR阈值有所恢复,但未恢复正常。结论通过暂时性微动脉夹夹闭双侧椎动脉及右侧颈总动脉,夹闭1小时制造缺血模型,松开三条动脉制造再灌注模型。可致耳蜗损伤,表现为听功能下降,在再灌注后6h、24h、48h,以24h听阈最高,即耳蜗损伤最为严重。第二部分PPTA对耳蜗缺血再灌注损伤的听力保护作用及耳蜗组织扫描电镜和透射电镜观察目的探讨盐酸椒苯酮胺(PPTA)对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后听功能及耳蜗形态的影响。方法采用前述的缺血再灌注模型,将32只豚鼠随机分为4组,每组8只,每组4只用于扫描电镜观察,剩余4只用于透射电镜观察。分为正常组,假手术组,缺血再灌注对照组,缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组。缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组再灌注后立即经股静脉注射盐酸椒苯酮胺,缺血再灌注对照组以等量生理盐水代替椒苯酮胺注射。测量实验前后各组的听性脑干反应(ABR)波Ⅲ反应阈的变化。24小时迅速断头取听泡,,在扫描电镜、透射电镜下观察耳蜗结构。结果1、正常组、假手术组实验前后ABR波Ⅲ反应阈值无显著变化(P>0.05),缺血再灌注对照组,造模成功后ABR波Ⅲ显著升高(P<0.05),缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组,造模成功后ABR波Ⅲ升高,但低于缺血再灌注对照组(P<0.05)。2、扫描电镜下观察耳蜗组织的形态学变化：正常组及空白对照组豚鼠耳蜗基底膜居外侧3排外毛细胞,1排内毛细胞呈刷状,排列整齐,内、外毛细胞纤毛排列整齐,无缺失、倒伏。缺血再灌注对照组外毛细胞肿胀、缺失,纤毛排列紊乱、倒伏,部分缺失。缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组少量外毛细胞有纤毛倒伏。3、透射电镜下观察：正常组及空白对照组耳蜗毛细胞细胞核圆、核染色质分布均匀,线粒体形态正常,分布均匀,毛细胞突触结构清晰。螺旋神经节神经元未见明显脱髓鞘改变,血管纹内皮细胞核呈梭形；IR组耳蜗毛细胞核边界不清,可见固缩、边集现象,突触结构消失。螺旋神经节可见大量脱髓鞘改变。血管纹内皮细胞核可见固缩、边集现象,呈现充血改变；缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组毛细胞核边界清楚,核染色质分布均匀,线粒体形态分布均匀,无明显肿胀,突触结构尚清晰。螺旋神经节可见少量脱髓鞘变。血管纹内皮细胞核膜完整,无固缩、边集现象。结论PPTA对豚鼠耳蜗的缺血再灌注听力损伤有保护作用,并且可以防止耳蜗缺血再灌注损伤后毛细胞的损伤缺失。第三部分盐酸椒苯酮胺对缺血再灌注后IL-1β和TNF-α的mRNA表达的影响目的1.探讨耳蜗炎性反应与缺血再灌注损伤的关系。2.探讨缺血再灌注后豚鼠耳蜗IL-1β和TNF-α的mRNA的表达与炎性反应的关系。3.探讨PPTA对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤的保护作用机制。方法采用前述的缺血再灌注模型,将24只豚鼠随机分为4组,每组6只,分别为正常组、假手术组、缺血再灌注对照组和缺血再灌注PPTA组。缺血再灌注PPTA组于缺血1小时再灌注后立即经股静脉注射盐酸椒苯酮胺(10mg/kg),缺血再灌注对照组以等量生理盐水代替椒苯酮胺注射,24小时后取标本。用RT-PCR法检测IL-1β和TNF-α的mRNA的表达。用SPSS13.0软件对实验数据进行方差分析,若满足方差齐性,用LSD检验比较组间差异,若不满足方差齐性,用Dunnett’sT3比较组间差异,P<0.05为有统计学意义。结果缺血再灌注对照组耳蜗组织IL-1βmRNA表达量显著高于正常组和假手术组(P<0.001)；缺血再灌注PPTA保护组耳蜗组织IL-1βmRNA表达量显著低于缺血再灌注对照组(P<0.001)；缺血再灌注PPTA保护组耳蜗组织IL-1βmRNA表达量与正常组差异无统计学意义(P=0.056>0.05)。缺血再灌注对照组耳蜗组织TNF-α mRNA表达量显著高于正常组和假手术组(P<0.001)；缺血再灌注PPTA保护组耳蜗组织TNF-α mRNA表达量显著低于缺血再灌注对照组(P<0.001)；缺血再灌注PPTA保护组耳蜗组织TNF-α mRNA表达量高于正常组(P=0.009<0.05)。结论1. PPTA具有拮抗耳蜗组织缺血再灌注损伤作用2. PPTA可能通过抑制炎性反应实现对耳蜗缺血再灌注损伤的拮抗作用第四部分PPTA对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后细胞凋亡和Fas蛋白、caspase-1的mRNA表达的影响目的：1.观察缺血再灌注损伤后豚鼠耳蜗细胞凋亡的情况。2.对缺血再灌注损伤后豚鼠耳蜗Fas蛋白、caspase-1的mRNA的表达与细胞凋亡间的关系进行分析。3.探讨PPTA对豚鼠缺血再灌注损伤后凋亡细胞的保护作用。方法：采用前述的缺血再灌注模型,将48只豚鼠随机分为4组,每组12只,分别为正常组、假手术组、缺血再灌注组对照组、缺血再灌注PPTA组(缺血60min行再灌注后立即经股静脉注射10mg/kg盐酸椒苯酮胺),缺血再灌注对照组以等量生理盐水代替椒苯酮胺注射,24小时后取标本。用免疫组织化学法(SP)观察Fas蛋白的表达和分布,并用Motic图象分析系统分析单位面积下阳性细胞的积分光密度(IOD)；用TUNEL法观察细胞凋亡的情况；用RT-PCR法检测caspase-1的mRNA的表达,并比较PPTA干预前后的变化。运用SPSS13.0统计软件对实验数据进行方差分析,用LSD检验比较组间差异,P<0.05为有统计学意义。结果：免疫组织化学染色见正常组、假手术组和缺血再灌注PPTA组耳蜗血管纹、螺旋神经节、Corti器Fas表达为弱阳性,缺血再灌注组表达显著增强。IOD值显示正常组、假手术组、缺血再灌注PPTA组之间差异无统计学意义(P>0.05),缺血再灌注组较其他三组显著增强(P<0.05)。TUNEL法显示正常组、假手术组和缺血再灌注PPTA组耳蜗各部位没有或仅有个别部位出现细胞凋亡,缺血及再灌注对照组耳蜗凋亡细胞明显增多,PPTA干预后凋亡细胞显著减少。缺血再灌注组耳蜗组织Caspase-1mRNA表达量显著高于正常组、假手术组和缺血再灌注PPTA组(P<0.001)；缺血再灌注PPTA组耳蜗组织Caspase-1mRNA表达量显著高于正常组(P<0.001)；正常组和假手术组耳蜗组织Caspase-1mRNA表达量差异无统计学意义(P=0.825)。结论：通过豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型PPTA及对照试验。正常组豚鼠耳蜗各部位Fas为弱阳性表达,无或罕有凋亡细胞。缺血再灌注组Fas表达增强,凋亡细胞增多,进行干预后使凋亡细胞显著减少。缺血再灌注耳蜗组织Caspase-1mRNA的表达显著增高,PPTA可部分但有效地降低Caspase-1mRNA的表达。提示细胞凋亡是耳蜗缺血再灌组损伤的一种细胞损伤形式,PPTA可能通过抑制Fas蛋白及Caspase-1mRNA的表达,通过减少细胞凋亡而对缺血再灌注损伤后的耳蜗起保护作用。