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背景胃癌是全球常见的恶性肿瘤形式,其发生发展的分子机制一直是生命科学研究的热点问题。肿瘤相关基因或特异基因表达水平的变化,多种信号转导蛋白和转录因子的激活均可导致肿瘤的发生及发展。同时,转录因子对基因的表达调控作用是肿瘤发生发展的关键因素之一,研究其在肿瘤中的具体表达调控模式,可能为肿瘤治疗提供新的预测指标和干预靶点。DEC1(Differentiated embryo-chondrocyte expressed gene)是一个生长发育基因,也是具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构的转录因子。以往关于DEC1的研究多集中于生物钟调控、细胞分化及免疫应答。近年来发现它与肿瘤发生发展密切关联,缺氧、血清饥饿、细胞因子、生长因子、感染等均可诱导肿瘤中DEC1信号通路的启动,并且其调控的靶基因都是参与细胞增殖及凋亡的重要分子。但DECl究竟是作为癌基因还是抑癌基因发挥作用充满争议。主要体现在：(1)DEC1在肿瘤中呈组织细胞特异性的表达模式,表达的上调或下调与肿瘤类型密切相关；(2)肿瘤中DEC1表达的临床意义尚不统一；(3)DEC1对肿瘤细胞增殖、凋亡的影响以及对抑癌基因和促癌基因的作用尚无定论。DEC1在肿瘤细胞中的这种双重作用主要与DEC1及其上下游调控分子的时空分布及表达量密切相关。因而需要更加深入的研究不同肿瘤中DEC1的表达调控模式。虽然我们的前期研究已表明,DEC1基因在胃癌组织中呈高表达,但DEC1基因的表达在胃癌发生发展中究竟是发挥抑癌作用还足促癌作用及其具体的机制尚不明确,这正是本研究拟解决的关键问题。目的1.检测DEC1在胃癌组织中的表达的表达,分析其表达水平与临床病理参数的相关性,以及与细胞增殖抗原Ki67表达的相关性,探讨其潜在的临床价值；2.建立DEC1慢病毒RNA干扰载体,获得稳定基因敲除的胃癌细胞,为研究DEC1表达调控作用提供良好的细胞模型；3.探讨DEC1对胃癌细胞增殖的调控作用及其机制,为明确其是否可作为胃癌治疗的新靶点提供实验依据。方法1.免疫组织化学染色法检测173例胃癌组织及相应癌旁正常组织中DEC1的表达情况,分析DEC1表达与胃癌临床病理参数之间的关系及其与Ki67表达的相关性。2.构建包装DEC1-shRNA慢病毒载体(pKL2099-DEC1shRNA)和阴性对照载体(pKL2099-NCshRNA)；在293T细胞中进行病毒包装和滴度测定；慢病毒载体感染胃癌细胞BGC823和MGC803细胞,筛选获得稳定转染细胞株；RT-PCR及western blot验证慢病毒载体的有效性。3.采用CCK-8实验、平板克隆形成实验、流式细胞术观察抑制DEC1表达对胃细胞体外增殖能力、克隆形成能力及细胞周期的影响。4.Annexin V-PE/7-AAD双染色法检测细胞的凋亡；Hoechst33258染色观察细胞凋亡的形态学变化。5.Western blot检测细胞凋亡相关分子Survivin.p53及Caspase3的表达变化。结果1.DEC1在胃癌组织和癌旁正常组织中的阳性表达率分别为83.8%和23.7%(P<0.05),并且DEC1的表达与组织的分化程度负相关(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期无关(P>0.05)；DEC1在胃癌组织中的的表达与Ki67蛋白的表达正相关(相关系数r=0.249,P<0.05)。2.通过阳性克降测序,证实针对DEC1及阴性对照的载体分别构建成功：两个慢病毒载体pKL2099-DEC1shRNA、pKL2099-shRNA滴度分别为3E+9TU/ml和6E+9TU/ml；嘌呤霉素(puromycin)筛选得到的稳定表达的细胞株bGC823-DEC1shRNA及MGC803-DEC1shRNA细胞中DEG1mRNA表达水平的抑制分别为(88.24%±1.47%)和(79.34%±1.09%),蛋白水平的抑制率为(75.43%±2.31%)和(69.36%±2.11),差异具有显著性(P<0.05)。3.稳定抑制DEC1表达的BGC823-DEC1shRNA(?)细胞与阴性对照组BGC823-NcshRNA细胞相比,增殖率明显下降(P<0.05)；平板克隆形成实验证实BGC823-DEC1shRNA组细胞形成克隆的数量明显低于BGC823-NCshRNA组细胞；流式细胞术测定细胞周期结果显示BGC823-DEC1shRNA组细胞处于G0/G1细胞增多,而S期与G2/M细胞减少,差异有显著性(p<0.05)。4. Annexin V-PE/7-AAD双染色法结果表明BGC823-DEC1shRNA组早期凋亡细胞比例高于阴性对照BGC823-NCshRNA (34.98%±1.05%vs5.95%±0.98),差异有显著性(p<0.05)。慢病毒感染胃癌细胞7d后,在BGC823-DEC1shRNA组细胞中可以观察到典型的核浓缩、核碎裂等细胞凋亡的形态学改变。5. Western blot结果提示,下调DEC1的表达后,细胞中的Survivin的表达下调,而p53s Caspase3表达上调。结论DEC1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁『正常组织,其表达水平随肿瘤病理分级增高而显著升高,著且与Ki67的表达『正相关,说明DEC1的高表达与胃癌的恶性进程密切相关；成功构建了靶向DEC1的慢病毒RNAi表达载体,分别感染胃癌细胞BGC823和MGC803,经嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选,建立了稳定抑制DEC1mRNA和蛋自表达的细胞株,为进一步研究DEC1的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础.下调DEC1表达可显著抑制胃癌细胞的体外生长及细胞周期进程,促进细胞的凋亡,分子机制可能是通过抑制DEC1下游抗凋亡分子Survivin的表达及上调凋亡分子p53、Caspase3表达相关。本研究提示,DEC1在胃癌的发生发展中可能扮演癌基因的角色,并在调控胃癌细胞的增殖和凋亡等恶性生物学特性中发挥重要作用。