促进干细胞增殖的龟板有效部位的化学成分研究

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龟板浸膏能促进鼠骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,bMMSCs)的体外增殖,在特定的条件下,能诱导bMMSCs向神经方向和成骨方向分化。 为了了解龟板浸膏中对鼠bMMSCs体外增殖起促进作用的化学成分,本文依次用石油醚、乙醚、二氯甲烷提取龟板浸膏,得到溶剂提取物,将一部分提取物甲酯化。用MTr比色法研究了溶剂提取物和甲酯化产物的干细胞活性,结果表明溶剂提取物和甲酯化产物均能促进鼠bMMSCs的体外增殖。为了证实MTT结果的准确性,我们又采用流式细胞仪检测,与MIT比色法的结果一致。采用GC-MS技术研究每一个提取物的挥发性成分,结果表明,溶剂提取物挥发性成分主要是脂肪酸,且十六烷酸、十八烷酸和十八烯酸含量较高,甲酯化产物含有脂肪酸甲酯,且十六烷酸甲酯、十八烷酸甲酯和十八烯酸甲酯含量较高。根据GC-MS结果,我们选择购买了九个物质作为标准品,采用HPLC进一步鉴定部分成分,确定甲酯化样品都含有十六烷酸甲酯,与GC-MS结果相吻合。根据MIT法对标准品干细胞活性的测试,十六烷酸甲酯、十八烷酸在O.15gg/pL低浓度时能明显促进bMMSCs增殖,在1.5μg/μL浓度时反而不能促进bMMSCs增殖,十六烷酸在O.15μg/μL和1.5μg/μL浓度时均能促进bMMSCs增殖,且增殖效果显著。GC-MS和HPLC所能检测的物质均不全面,我们进一步研究了龟板浸膏GC-MS生物活性指纹图谱,用两个指纹图谱来预测中药“四物汤”的干细胞活性,平均预测准确率达85.4﹪,这表明运用指纹图谱预测其它中药样品的干细胞活性,有一定的可靠性,但也存在一定的误差。 为了对比胆甾醇十四烷酸酯、胆甾醇十六烷酸酯、胆甾醇十八烷酸酯的干细胞活性,了解同系列甾酯的干细胞活性是否与碳原子数有关,本文合成了胆甾醇十六烷酸酯、胆甾醇十八烷酸酯,并用MTT法评价了其干细胞活性。三个甾酯中甾醇十六烷酸酯在0.151xg/pL浓度时能促进bMMSCs增殖。 初步结果表明,龟板浸膏中起到调控鼠bMMSCs增殖作用的物质可能是脂肪酸、脂肪酸酯、甾酮和甾酯,而且促进干细胞增殖不是单个分子的作用,而是多个分子协同作用的结果。相同浓度下,既有起促增殖作用的物质,也有起抑制作用的物质,这为龟板浸膏促进bMMSCs增殖又不引起bMMSCs过度生长的分子机制提供实验依据,也为研究中医中药配伍理论(君、臣、佐、使)提供了化学物质基础。
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