【摘 要】
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透明质酸（Hyaluronic acid,HA）是一种以D-葡萄糖醛酸（GlcUAc）和N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）二糖为单元聚合而成的多聚糖,根据分子量不同表现出不同的生物活性。透明质酸寡糖的分子量在10 kDa以下,能够抑制皮肤细胞氧化损伤、修复紫外损伤细胞、降低细胞内活性氧自由基和治疗癌症,具有重要的功能。酶法制备透明质酸寡糖,具有反应条件要求温和,产量较高,专一性强等优势,是工业
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透明质酸（Hyaluronic acid,HA）是一种以D-葡萄糖醛酸（GlcUAc）和N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）二糖为单元聚合而成的多聚糖,根据分子量不同表现出不同的生物活性。透明质酸寡糖的分子量在10 kDa以下,能够抑制皮肤细胞氧化损伤、修复紫外损伤细胞、降低细胞内活性氧自由基和治疗癌症,具有重要的功能。酶法制备透明质酸寡糖,具有反应条件要求温和,产量较高,专一性强等优势,是工业化大规模生产最理想的方法。透明质酸酶是一类分解透明质酸的酶。微生物来源的透明质酸酶大多为透明质酸裂解酶,以β-消除机制降解透明质酸,生成不饱和透明质酸寡糖。本研究首先对苜蓿链霉菌Streptomyces alfalae ACCC40021全基因组在碳水化合物活性酶数据库（CAZy）中进行了分析,发现了一种属于多糖裂解酶第8家族透明质酸裂解酶SaHyaL。序列比对表明:其与已知透明质酸裂解酶相似性低,是一种新型的透明质酸裂解酶。以苜蓿链霉菌S.alfalae ACCC40021基因组为模板,对透明质酸裂解酶Sahyal基因进行了 PCR扩增,大小为2520 bp,并成功构建了pET28a-SUMO-Sahyal重组质粒。20℃诱导温度下,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了 SaHyaL可溶性表达。同时,利用小分子泛素样特异性蛋白酶（Ubiquitin Like specific Proteas,ULP）和SUMO-SaHyaL融合蛋白在细胞内共表达,去除SUMO标签。经镍柱纯化和SDS-PAGE检测,结果表明重组SaHyaL蛋白分子量大小为89.5 kDa,与预测一致。该酶最适反应温度为50℃,最适pH为7.0,在20-50℃范围和pH 5.0-10.0范围内酶活稳定;以透明质酸为底物,Km为0.31 mg/mL,Vmax为135.14μmol/min/mg。薄层层析TLC结果表明:该酶是一种外切酶。利用高效液相色谱HPLC监测酶解透明质酸的过程,6 h时转化率达到97.4%。电喷雾离子源质谱检测确定产物为不饱和透明质酸二糖。本研究结果表明:SaHyaL具有工业化生产不饱和透明质酸二糖的潜力。
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