胚胎睾丸支持细胞（embryonic Sertoli cells,eSCs）是雄性胚胎发育过程中形成的第一种雄性特异性细胞,对性别决定具有至关重要的作用,并且分泌多种营养物质,能够对其它种类细胞,如精原干细胞（spermatogonia stem cells,SSCs）起到支持扩增或分化等功能。因此,对胚胎睾丸支持细胞发育形成机理进行研究有助于揭示胚胎性腺发育和性别决定机制,为将来的临床应用提供指导作用。然而,采用常规的组织分离方法从小鼠雄性胚胎中难以大量提取胚胎睾丸支持细胞,阻碍了对胚胎睾丸支持细胞的基础理论研究和实验应用。因此,建立新的胚胎睾丸支持细胞的体外诱导获取方法具有重要意义。近年来,有研究添加维甲酸（retinoic acid,RA）和激活素A（ActivinA）等物质,诱导小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）分化形成中间中胚层（intermediate mesoderm,IM）来源细胞,再通过卵泡刺激素（follicle stimulating hormone,FSH）等蛋白因子化合物诱导胚胎睾丸支持样细胞（embryonic Sertoli-like cells,eSLCs）的形成。然而,这种诱导分化方法的分化途径和分子机制仍未阐明。另有研究将成纤维细胞进行基因重编程,通过转分化方式诱导出胚胎睾丸支持样细胞,表明5种发育相关因子Wt1、Gata4、Sf1、Sox9和Dmrt1的表达可能对胚胎睾丸支持细胞的形成具有重要功能。因此,本论文根据以上小鼠胚胎睾丸支持样细胞的诱导方法,结合已知的胚胎睾丸支持细胞在体内的发育途径和分子机理,首先在体外诱导小鼠胚胎干细胞分化形成中间中胚层来源细胞,接着通过对Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子分别进行时序性调控表达,成功诱导形成小鼠胚胎睾丸支持样细胞,建立了一种新的小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型。主要结果如下:一、比较并建立了小鼠胚胎干细胞培养和分化诱导方法。为提供分化潜能状态良好的大量小鼠胚胎干细胞,研究比较了不同滋养层和培养条件,结果表明采用TM4细胞来源的条件培养基和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEF）滋养层进行培养,提高了小鼠胚胎干细胞复苏后的聚集和增殖能力。为建立合适的小鼠胚胎干细胞诱导方法,本研究首先根据已知方法通过添加维甲酸和激活素A诱导小鼠胚胎干细胞向中间中胚层来源细胞进行分化。接着,针对Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子,比较了直接在细胞中进行转录表达调控和添加外源重组蛋白两种方法的诱导效果。结果表明通过慢病毒介导的转录表达调控方法更能有效诱导潜在的小鼠胚胎睾丸支持细胞祖细胞,即体腔上皮样细胞（coelomic epithelial-like cells）（CK18+）和性腺发育相关细胞（AMH+）的分化形成。二、建立了小鼠胚胎干细胞向小鼠胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型。为了在体外模拟出体内小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持细胞的发育途径,研究根据小鼠胚胎中雄性性腺细胞的发育规律,在小鼠胚胎干细胞向中间中胚层来源细胞诱导分化后,采用四环素启动子和光控启动子控制Wt、G1ata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子进行时序性表达,并在诱导14天后鉴定出有潜在的胚胎睾丸支持样细胞（FSHR+/AMH+）形成。通过细胞形态学、特异性标志物的蛋白表达和标志性基因的转录表达,鉴定和分析了小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化的过程。结果表明:小鼠胚胎干细胞在0-8.5天分化形成中间中胚层来源细胞;在9.5-11.5天从中间中胚层来源细胞中分化形成体腔上皮体细胞样细胞（coelomic epithelial somatic-like cells）;在11.5-12.5天体腔上皮体细胞样细胞分化为SF1阳性前体样细胞（SF1-positive precursor-like cells,SPLCs）,并发育为 SF1 阳性性腺前体样细胞（SF1-positive gonadal precursor-like cells,SGPLCs）;在12.5天之后SF1阳性性腺前体样细胞发育形成胚胎睾丸支持样细胞;在12.5-14.5天,胚胎睾丸支持样细胞形成环状结构;在14.5天之后,细胞组成的环状结构继续发育为管束状结构,与小鼠睾丸生精小管骨架结构相似。这些结果显示,建立的小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化过程与已知的小鼠胚胎内性腺发育和细胞分化途径相似。三、初步鉴别6种发育相关因子对小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化途径的诱导作用。研究通过对6种发育相关因子Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1的表达调控进行组合,利用不同细胞的特异性标志物进行鉴定,初步鉴别出这些因子对小鼠胚胎干细胞诱导分化途径的影响。结果表明Wt1和Gata4拘调控表达与分化形成体腔上皮体细胞样细胞有关;Sf1基因的表达与SF1阳性前体样细胞和SF1阳性性腺前体样细胞的形成相关;Sry和Sox9基因在诱导作用上表现相似,与SF1阳性性腺前体细胞向雄性分化决定的过程相关;Dmrt1基因的表达影响到胚胎睾丸支持样细胞形成的细胞数量。四、基于小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型,研究不同发育分化阶段的分子机理。为了探索小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化机理,研究将分化过程分为三个阶段:（1）体腔上皮体细胞样细胞、SF1阳性前体样细胞和SF1阳性性腺前体样细胞的分化形成阶段;（2）SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞的分化阶段;（3）胚胎睾丸支持样细胞发育维持阶段。分子机制主要采用慢病毒转染方法调控目标因子进行过表达,或采用CRISPR/Cas9敲除（knock out,KO）方法抑制目标因子的表达来进行研究。结果显示:（1）Wt1基因的过表达有利于激活体腔上皮组织发育相关基因,并上调Gata4和Sf1的转录表达。Gata4能激活功能因子Lhx9进行表达。Wt1和Gata4可能对体腔上皮体细胞样细胞和SF1阳性前体样细胞分化形成具有重要作用;（2）Sf1能激活Amh、Amhr2、Insl3、Dax1等因子的表达,并促进体腔上皮体细胞样细胞向SF1阳性前体细胞的分化发育。另外,Sf1基因的表达可能对细胞的上皮样向间质样形态转变（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）、迁移和聚集能力具有影响。Sf1无法单独激活雄性分化决定关键因子Sry和Sox9的表达。然而,Sf1的表达缺失将阻碍雄性分化决定过程;（3）Sry和Sox9是雄性分化决定的关键基因。Sry的过表达能激活Sox9进行表达,然而Sox9的过表达无法单独激活Sry进行表达。Sry或Sox9的过表达能激活一些相似的雄性分化决定相关下游基因,促进SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞进行诱导分化。在Sry和Sox9不表达的情况下,SF1阳性性腺前体样细胞可能发生雌性分化决定过程,向卵巢支持样细胞（ovarian supporting-like cell）（AMH+/WNT4+）进行分化发育;（4）Dmrt1的过表达能激活Amh、Ptgds、Fgt9、Gdnf等雄性发育相关的功能因子,抑制Wnt4、Foxl2等雌性分化决定因子,从而帮助维持雄性发育过程、保持胚胎睾丸支持样细胞的生理特性、促进其形成生精小管的组织结构、并避免发生睾丸支持样细胞向卵巢支持样细胞的转化。五、诱导胚胎睾丸支持样细胞的功能成熟,并检验其生理特性和生精滋养功能。为验证这些诱导胚胎睾丸支持样细胞是否具有与天然胚胎睾丸支持细胞相似的潜在生理功能和特性,实验先采用包含睾酮等物质的条件培养基促进诱导形成的小鼠胚胎睾丸支持样细胞的发育和功能成熟,再通过流式细胞分选后用于小鼠睾丸组织的细胞移植试验和精原干细胞共培养试验。结果显示,在小鼠睾丸生精小管移植实验中,注入的睾丸支持样细胞能够与小鼠自身睾丸细胞相融合、分散生长、并无明显成瘤性,与阳性对照组中异源小鼠睾丸提取的成熟睾丸支持细胞的移植结果相似,表明这些诱导睾丸支持样细胞的生理特性接近于天然形成的成熟睾丸支持细胞;在精原干细胞共培养试验中,诱导睾丸支持样细胞能够滋养精原干细胞发育为雄性配子样细胞,表明诱导出的睾丸支持样细胞具备一定的生殖细胞滋养功能。综上,本论文建立了一种小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型,并基于模型研究了相关的分子机理,为胚胎发育学、性别决定机理和临床应用提供了研究基础和技术平台。