玉米(Zea mays L.),禾本科,玉蜀黍属,基因组大小约为2.5×103Mb,是一种重要的经济作物,并且常作为遗传学研究的模式生物。动物实验研究中胚胎干细胞的分化发育机制一直是研究的热点。而在植物中,关于组织分化的研究还比较少。本研究以玉米根尖分生区及成熟区为实验材料,从细胞学及表观遗传方面来研究根尖细胞分化过程中两个区域之间的差异,主要有以下几个方面的工作:1.玉米根尖分生区及成熟区细胞学水平的差异首先通过福尔根染色法确定根尖分生区与成熟区的区域。接着采用DAPI染色法观察了两个区域中细胞核之间的差异,其结果为:分生区中细胞核面积较小但比较均一,成熟区核面积较大但大小不均一,同时还发现两区域中均出现了含染色中心的细胞核。分生区细胞核中的染色中心较小,染色中心的染色质较松散,成熟区细胞核中的染色中心较大,染色中心的染色质较凝缩。另外核仁面积大小在两个区域细胞核中也有明显差异,分生区中核仁相对大、核仁占比也较高,成熟区中则相对较小。2.玉米根尖分生区及成熟区细胞核中染色质构型及全基因组DNA甲基化水平的差异我们采用微球菌核酸酶敏感性实验及高效液相法检测玉米根尖不同区域细胞核中染色质构型及全基因组DNA甲基化水平的差异,结果显示分生区细胞核中染色质对微球菌核酸酶敏感性较强,染色质较松散,易被切成短片段,整体DNA甲基化水平较低;成熟区细胞核中染色质则相对凝缩,整体DNA甲基化水平较高。3.玉米根尖分生区及成熟区细胞核中Knob及45S rDNA序列的表观遗传水平的差异根据以上结果,染色中心和核仁在玉米根尖分生区和成熟区细胞核中显示出了较大的差异。玉米细胞核染色中心大部分由重复序列组成,而Knob重复序列是其中组成较多的成分。45S rDNA重复序列是核仁的重要组成部分,参与了核糖体的形成。因此,我们主要研究分生区和成熟区细胞核中这些重复序列的表观遗传差异。(1)玉米根尖分生区及成熟区细胞核中Knob重复序列的表观遗传水平的差异分析Knob主要包括180-bp和350-bp两种重复序列,通过CHART-PCR(Chromatin Accessibility by Real-Time PCR)检测Knob两种重复序列的染色质凝缩状态。结果显示Knob两种重复序列的染色质构型在分生区中相对松散,成熟区较凝缩,荧光原位杂交实验也验证了这一结果。接着我们又采用重亚硫酸盐测序技术对玉米根尖分生区与成熟区细胞核中Knob两种重复序列DNA甲基化水平进行了分析。植物中DNA甲基化有CG、CHG、CHH 三种类型,Knob 180-bp 序列中 CHG 类型和 Knob 350-bp 中 CHH 类型及总的DNA甲基化水平成熟区显著高于分生区。(2)玉米根尖分生区及成熟区细胞核中核仁活性及45S rDNA的表观遗传水平的差异分析核仁参与核糖体的合成、pre-rRNA的加工和剪切等生命活动。银染结果显示分生区银染颗粒多于成熟区,分生区核仁活性高于成熟区。接着我们采用荧光免疫染色技术,利用核仁纤维蛋白为抗体,分析玉米根尖分生区与成熟区中核仁纤维蛋白的信号分布。结果为分生区中核仁大而圆,核仁核纤维蛋白信号较亮且与DAPI染色空洞区重合,成熟区核仁核纤维蛋白信号较弱,只在与DAPI染色空洞区周围呈散点分布,该结果与DAPI染色的结果一致,再次验证了分生区核仁活性较成熟区高这一结果。CHART-PCR结果显示,45S rDNA的染色质构型在分生区中相对松散,成熟区较凝缩,荧光原位杂交实验也验证了这一结果。45S rDNA序列中CG类型各个甲基化位点的甲基化水平分生区较低,成熟区较高,且在某些特殊位点差异显著,而CHG与CHH两种类型的甲基化水平特别低且在两个区域中无显著性差异。综上所述,植物根尖细胞在分化过程中,染色质发生了重塑,分生区中染色质较松散,DNA甲基化程度较低,而成熟区中染色质较凝缩,DNA甲基化程度较高。