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目的:本研究的目的是在本课题组前期成功获得香菇C91-3转录组的基础上继续挖掘香菇中具有抗肿瘤活性的单一蛋白。将具有RCC1+ANK结构域的Lp-4基因序列通过克隆后连接至重组表达质粒,利用表达菌株Ecoli.Rosetta-g ami（DE3）获得该蛋白。初步探讨研究LP4-RCC1+ANK蛋白对人肝癌细胞HepG2的生长抑制活性;为后续机制的研究奠基了根柢。方法:1.通过Trizol法得到香菇C91-3菌株发酵液中菌丝体总RNA,通过反转录获得cDNA文库,参照其测序结果,应用生物信息学软件进行预测、比对,获得与抗肿瘤活性相关的基因序列,通过RACE法获得Latcripin-4基因全长[1]。2.设计引物,利用PCR技术获得Latcripin-4结构域片段,表达载体pET32a酶切后,将Latcripin-4目的基因片段连接至载体,再将重组后的质粒pET32a（+）-LP4转化至表达菌株Ecoli.Rosetta-gami（DE3）中进行诱导表达,并将产物通过SDS-PAG及Western-blot等方法进行鉴定。3.LP4-RCC1+ANK蛋白多数以包涵体形式存在,裂解细菌后收集菌体沉淀,用含去污剂的洗涤液初步分离后再通过磁珠纯化的方法得到纯度较高的LP4-RCC1+ANK蛋白,再利用稀释的方法使蛋白进行重新折叠,透析后PEG浓缩,BCA法测定其浓度。4.LP4-RCC1+ANK蛋白抗肿瘤活性的鉴定:cck8法测定LP4-RCC1+ANK蛋白对人肝癌HepG2细胞的生长抑制率;透射电镜法、姬姆萨染色法观察细胞形态的变化,Hoechst33258染色法检测LP4-RCC1+ANK蛋白对人肝癌HepG2细胞的促凋亡现象。同时用CCK8法检测LP4-RCC1+ANK蛋白对人正常永生化表皮细胞的毒性作用。结果:1.利用RACE法得到Latcripin-4基因编码序列,并通过PCR技术成功获得Latcripin-4结构域片段基因序列。软件分析得到Latcripin-4功能结构域信息,发现该蛋白包含有多个染色体浓缩调节蛋白结构域（RCC1）和锚重复序列结构域（ANK）。2.经过XhoⅠ/BamHⅠ双酶切验证Latcripin-4结构域片段成功转入表达质粒。3.通过SDS-PAG及Western-blot证实:LP4-RCC1+ANK蛋白在菌株中成功诱导表达,且LP4-RCC1+ANK蛋白为包涵体蛋白。分离目的蛋白后,磁珠纯化法成功获得较纯的LP4-RCC1+ANK蛋白。BCA法测定目的蛋白浓度。4.CCK8法检测LP4-RCC1+ANK蛋白复性后的生物学活性,结果显示:LP4-RCC1+ANK蛋白对人肝癌HepG2细胞系的生长具有明显的抑制活性（p<0.05）;透射电镜、姬姆萨染色、Hoechst33258荧光染色结果均显示:LP4-RCC1+ANK蛋白作用后的HepG2细胞出现凋亡现象,对照组无明显变化。5.C CK8法检测细胞毒性实验结果显示,LP4-RCC1+ANK蛋白对正常人永生化表皮细胞无毒性作用。结论:1.成功获得LP4基因全长。2.成功构建重组表达质粒。3.成功诱导并纯化LP4-RCC1+ANK蛋白。4.CCK8结果证明LP4-RCC1+ANK蛋白具有明显抑制人肝癌HepG2细胞增殖的作用。电镜、姬姆萨染色及Hoechst33258荧光染色结果证明LP4-RCC1+ANK蛋白有促进人肝癌HepG2细胞凋亡的作用。5.L P4-RCC1+ANK蛋白对人正常永生化表皮细胞无毒性作用。