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壳聚糖为一种广谱抑菌剂,对多种细菌、真菌的生长和繁殖都能起到一定的杀菌效果,同时作为非抗生素药物,不容易引起致病菌种产生抗药性,对比一般的抗生素药物其安全性更高,因而在生物医用领域有较好的应用。然而,单纯的壳聚糖对多种致病菌的杀菌效果并不显著,所以本论文尝试将天然抗菌剂溶菌酶与壳聚糖联合使用,并适量添加醋酸氯己定,以增强对包括多重抗菌细菌在内的多种菌种的优异的抑菌、杀菌效果。
本文采用纸片扩散法考察了壳聚糖溶液浓度、溶菌酶溶液浓度和醋酸氯己定溶液浓度分别对金黄色葡萄球菌(St.aureus),大肠杆菌(E.coli),铜绿假单胞菌(P.aeruginosa),白色念珠菌(M.albicans)的抑菌性能;采用对倍稀释法测定壳聚糖对St.aureus,E.coli,P.aeruginosa,M.albicans的最小抑菌浓度(MIC)以及最小杀菌浓度(MBC)。结果表明,随着壳聚糖浓度增加,其对四种受试菌的抑菌性都增大;醋酸氯乙定对St.aureus,E.coli,P.aeruginosa,M.albicans的抑菌作用也随其浓度增加而呈明显增大趋势,当醋酸氯己定浓度低于0.25%时,则无抑菌性;而对于溶菌酶,其在0.0625%~2%的浓度范围内对四种受试菌几乎无抑菌性。壳聚糖对St.aureus,E.coli.P.aeruginosa,M.albicans的最小抑菌浓度(MIC)分别为:0.05%、0.1%、0.0125%、0.05%;对St.aureus,E.coli,P.aeruginosa的最小杀菌浓度(MBC)分别为:0.05%、0.2%、0.05%,而在所测浓度范围(0.0125%~0.2%)内对M.albicans则无杀菌作用。
通过壳聚糖、溶菌酶和醋酸氯己定溶液三种不同溶液的复配,并采用定量法分别测定不同复配体系的杀菌率,确定最佳复配体系配方:0.2%的壳聚糖、1%的溶菌酶以及0.03%的醋酸氯己定,此时复配体系对St.aureus,E.coll,P.aeruginosa,M.albicans四种受试菌的10min杀菌率均达到了100%。该最佳复配体系经过加速试验在54℃恒温箱内放置14天后,壳聚糖复配体系的杀菌率保持在90%以上,稳定性良好,此复配液的杀菌作用在室温下至少能保持一年以上。
分别利用紫外吸收光谱、荧光光谱和透射电镜初步探究了复配体系对大肠杆菌细胞膜的影响。结果表明,当壳聚糖复配体系(0.2%壳聚糖、1%溶菌酶和0.03%醋酸氯己定)作用于大肠杆菌后,其在260nm附近和280nm附近有明显的紫外吸收峰,这是由于其细胞膜遭到了严重破坏,导致了细胞膜内物质(DNA、RNA以及蛋白质物质等)大量外渗。
荧光光谱实验表明,当壳聚糖、溶菌酶和醋酸氯己定三者复配后,大肠杆菌细胞膜Trp荧光强度显著增强,且荧光强度明显强于单组分体系以及壳聚糖与溶菌酶、壳聚糖与醋酸氯己定的二组分复配体系。这可能是由于壳聚糖、溶菌酶和醋酸氯己定三者复配后,破坏了整个细胞膜结构,使细胞膜破裂,致使包埋在细胞内部的氨基酸残基全部裸露在外,因而极大地增加了细胞膜Trp的荧光强度,并且外泄的细胞内容物中所含有的蛋白质成分可能也对荧光强度的增加有一定贡献。
TEM观察显示,经处理后的大肠杆菌,其外在形态和内在结构均发生了变化,且对菌体破坏程度为:三组分复配体系>二组分复配体系>壳聚糖单组分。
通过紫外吸收光谱、荧光光谱和TEM观察结果,证实了壳聚糖、溶菌酶和醋酸氯己定(CHA)三者复配后,对菌体细胞的破坏起到了协同增效作用的结论。