近年来,临床上应用局部麻醉药给患者进行神经阻滞和椎管内麻醉以及术后镇痛的比率逐年增多,但是在工作中发现,部分病人应用局部麻醉药后发生神经系统并发症。早期的一些研究表明,局部麻醉药对神经组织的毒性与其剂量、浓度和作用时间成正相关。离体和在体的实验显示,局部麻醉药可剂量依赖性地造成神经组织肿胀、退变、脱髓鞘、空泡化和染色体溶解等。但局部麻醉药引起神经毒性的确切机理还未完全阐明。布比卡因是临床常用的局部麻醉药之一,其引起神经及心血管毒性反应的报道逐渐增多,并引起高度关注。研究发现,布比卡因通过抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ和干扰氧化磷酸化,使ATP生成减少,并可增加线粒体通透性和降低线粒体膜电位,使细胞凋亡。另有研究发现布比卡因可诱导Schwann细胞内的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)大量增多,并激活caspase-3(细胞内与凋亡有关的蛋白酶),触发细胞凋亡。但布比卡因增加线粒体通透性、降低线粒体膜电位和触发ROS产生、释放的启动因素是什么?目前尚不清楚。单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是一种丝／苏氨酸蛋白激酶,由α、β、γ三个亚单位构成,其中α亚单位是催化亚单位,β、γ是调节亚单位。它普遍存在于真核细胞中,参与细胞能量代谢的调控。研究表明,当细胞内ATP减少,AMP/ATP比率增高时,AMPK激酶系统被激活,抑制合成代谢途径,以减少ATP的消耗,并同时促进分解代谢途径,以增加细胞内ATP的产生。另有研究证实,AMPK的持续激活可引起细胞内ROS产生增多并导致细胞凋亡。因此,推测布比卡因可能通过干扰氧化磷酸化和抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ,使ATP生成减少,导致AMPK持续激活,并引起细胞内ROS爆发性增多,从而导致细胞凋亡细胞凋亡主要经过两条信号转导途径。其一是死亡受体途径,细胞表面的死亡受体通过其细胞外结构域与相应的死亡配体结合,将细胞外凋亡信号传入细胞内,激活caspase-8,而后激活caspase-3,从而启动细胞凋亡；其二是线粒体途径,氧自由基、钙超载等刺激因素可使线粒体通透性增加,线粒体膜电位下降,释放细胞色素C和凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF),进而激活caspase-9和下游的caspase-3,导致细胞凋亡。细胞凋亡与线粒体通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)开放有关。mPTP由电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel, VDAC)、腺苷酸运输体(adenine nueleotide translocator, ANT)和亲环素D (cyclophilin D, Cyp-D)构成。Cl-可以从开放的VDAC通道进入线粒体内,并能引起线粒体膜损伤和膜电位下降,导致分布在线粒体膜间的细胞色素C、AIF等促凋亡分子释放。因此,布比卡因引起细胞内ROS增多后可能通过促使VDAC开放,导致Cl-流入线粒体内,使线粒体的渗透压增高、基质肿胀、膜电位降低和通透性增大,释放促凋亡因子,最终使细胞凋亡p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)是丝裂原活化蛋白激酶家族重要成员之一,许多应激性刺激如H2O2、TNF-α脂多糖、高渗液等均能使p38 MAPK信号途径激活。近年来的研究发现,p38 MAPK信号途径通过控制多种转录因子的基因表达活性,影响多种细胞因子的产生,调节一氧化氮和细胞骨架蛋白的合成,参与应激条件下细胞的免疫调节、炎症反应和细胞凋亡等过程。研究发现利多卡因周围神经毒性与p38 MAPK的激活密切相关。Lirk等发现p38MAPK抑制剂4-(4-Fluorophenyl)-2-[4-(methylsulfinyl)phenyl]-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole (SB203580)可抑制利多卡因诱发的神经细胞轴突退变。有研究提示,p38 MAPK可能参与疼痛信号因子的活化,它在痛觉的中枢敏感化形成和发展中可能具有重要作用。因此,推测p38 MAPK与布比卡因的神经损伤作用密切相关。本研究将构建的重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2和pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2分别转染SH-SY5Y细胞,调节AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞中的表达,研究布比卡因是否通过AMPK导致细胞内ROS大量增多和细胞凋亡。另一方面,在Cl-通道阻滞剂4,4’-diisothiocyanatostilbene-2,2’-disulfonic acid disodium (DIDS)和p38 MAPK抑制剂SB203580干预的情况下,研究布比卡因所致细胞损伤中磷酸化p38 MAPK (p-p38 MAPK)和线粒体内Cl-浓度的变化,以明确ROS的作用靶点。第1章人AMPKα2基因pEGFP-N1-AMPKα2表达载体的构建和鉴定目的构建表达人AMPKα2基因的pEGFP-N1-AMPKα2载体,转染SH-SY5Y细胞株,观测其上调AMPKα2基因表达的效果。方法依据人AMPKα2基因序列,设计针对AMPKα2基因的特异引物。培养人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y cell line)并提取细胞总RNA。RT-PCR法扩增AMPKα2基因片段,琼脂糖凝胶电泳后回收、纯化扩增产物,并连接到pEGFP-N1质粒载体上。连接产物转化入感受态大肠杆菌DH5α进行扩增后,提取重组质粒。重组质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鉴定后进行DNA测序。用质脂体将重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染到SH-SY5Y细胞株,经G418筛选阳性克隆细胞后,用RT-PCR和Western blot法检测AMPKα2的mRNA和蛋白表达水平。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 13.0统计软件分析。吸光度值采用完全随机单因素方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’sT3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果提取得到SH-SY5Y细胞总RNA。RT-PCR得到大小约为1659 bp目的条带。从琼脂糖凝胶中回收的目的条带成功连接到]pEGFP-N1质粒载体。经DNA测序和酶切鉴定表明,重组质粒表达载体pEGFP-N1-AMPKα2构建成功。将重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染SH-SY5Y细胞株后,细胞中AMPKα2的]mRNA和蛋白表达水平较未转染组有明显增高(P<0.01)。结论成功构建了人AMPKα2基因的pEGFP-N1-AMPKα2表达载体。pEGFP-N1-AMPKα2能有效上调AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞株中的表达,为将来应用其研究AMPK在布比卡因致细胞损伤中的作用奠定了基础。第2章人AMPKα2基因shRNA表达载体的构建和鉴定目的构建针对人AMPKα2基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体,转染SH-SY5Y细胞株,观测其对AMPKα2基因的沉默效果。方法利用Ambion在线设计软件设计4段针对人AMPKα2基因的shRNA干扰序列并设计1段阴性对照序列,化学合成shRNA的正义链和反义链后,将双链shRNA和pGPU6/GFP/Neo质粒载体连接。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,在卡那霉素抗性平板上筛选重组质粒载体,扩增抗性菌落并提取质粒。各个重组质粒分别进行酶切鉴定。收集酶切鉴定为正确的重组质粒进行DNA序列测定。用质脂体将重组质粒转染SH-SY5Y细胞株,经G418筛选阳性克隆细胞后,用RT-PCR和Western blot法检测AMPKα2的mRNA和蛋白表达水平。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 13.0统计软件分析。吸光度值采用完全随机单因素方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’sT3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果经DNA测序和酶切鉴定表明,4个shRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(1), pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(2), pGPU6/GFP/Neo=shRNA AMPKα2(3), pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(4)和阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo NC构建成功。将4个重组质粒和阴性对照质粒转染SH-SY5Y细胞后,pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(3)转染组的AmRNA和蛋白表达水平明显低于未转染组和阴性对照组(P<0.01)。pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(3)能有效抑制AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞中的表达,抑制率为63%。结论成功构建了4个针对人AMPKα2基因的shRNA表达载体和阴性对照质粒。pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(3)能有效抑制AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞株中的表达,为将来应用其研究AMPK在细胞损伤中的作用奠定了基础。第3章AMPK对布比卡因致SH-SY5Y细胞ROS增多和凋亡的影响目的探讨布比卡因是否通过激活AMPK致SH-SY5Y细胞内ROS增多并导致细胞凋亡。方法将细胞分为pEGFP-N1-AMPKα2组(AMPKα2组),pEGFP-N1组(blank组),pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2组(siAMPKα2组),pGPU6/GFP/ Neo NC组(NC组)和未转染任何质粒的对照组(control组)。Western blot法检测AMPKα2和磷酸化AMPKα2 (p-AMPKα2)蛋白表达。各组细胞用含1mmol/1布比卡因的培养液处理。流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测布比卡因处理1、2、3、4、5 h后各组细胞内ROS含量。收集布比卡因处理24 h后的各组细胞,行MTT检测细胞存活率、Hoechst 33258染色法和FCM检测细胞凋亡率。同时,未用布比卡因处理的各组细胞在相同时间点检测上述相同的指标。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 13.0统计软件分析。质粒转染后AMPKa2蛋白表达量采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法；p-AMPKα2蛋白表达量采用校正的F检验Welch法,组间比较采用Dunnett’s T3法。布比卡因处理后细胞存活率、ROS含量、p-AMPKα2蛋白表达量和细胞凋亡率采用两因素析因设计资料方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’s T3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果转染质粒后,AMPKα2组的AMPKα2蛋白表达显著高于control组(P<0.01), siAMPKα2组的AMPKα2蛋白表达显著低于control组(P<0.01)。布比卡因处理后,AMPKα2组的p-AMPKα2蛋白表达显著高于control组(P<0.01),siAMPKα2组的p-AMPKα2蛋白表达显著低于control组(P<0.05)。各组细胞经布比卡因处理后,细胞内ROS含量逐渐增多,第3h达高峰；各组细胞内ROS水平在第4、5 h出现下降趋势；AMPKα2组的ROS水平在第1、2、3、4、5 h均高于其它组(P<0.01)；在第2、3和4 h,siAMPKα2组ROS水平低于blank组、NC组和control组,差异有统计学意义(P<0.01)。MTT结果显示,布比卡因处理后AMPKα2组存活率为38.92±4.76%,低于control组(52.46±2.93%)(P<0.01);siAMPKα2组存活率为65.80±4.10%,高于control组(P<0.01)。FCM检测结果显示,布比卡因处理24 h后AMPKα2组细胞凋亡率为40.22±3.11%,高于control组(31.76±3.73%)(P<0.01);siAMPKα2组细胞凋亡率为23.34±3.68%,低于control组(P<0.01)。Hoechst33258染色法检测显示,经布比卡因处理后AMPKα2组出现浓染致密的颗粒状荧光、染色质固缩、亮蓝色的凋亡细胞,其凋亡率为42.82±1.96%,高于control组(32.57±3.18%) (P<0.01); siAMPKα2组细胞凋亡率为22.21±2.76%,低于control组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论下调AMPKα2的表达可抑制布比卡因诱导的ROS产生和细胞凋亡,上调AMPKα2的表达可促进布比卡因诱导的ROS产生和细胞凋亡。布比卡因可能通过激活AMPK致SH-SY5Y细胞ROS爆发性产生并引起细胞凋亡第4章布比卡因对SH-SY5Y细胞线粒体和p38 MAPK的影响目的研究布比卡因对SH-SY5Y细胞线粒体和p38 MAPK的影响,探讨布比卡因致细胞ROS增多后,ROS的下游作用靶点。方法将SH-SY5Y细胞随机分为4组：DIDS组、SB203580组、-DIDS+ SB203580组和无预处理组(non-pretreated组)。DIDS组、SB203580组和DIDS+ SB203580组细胞分别经50μmol/l DIDS.10μmol/l SB203580、50μmol/l DIDS+10μmol/l SB203580预处理30 min后用含1 mmol/l布比卡因的培养液处理细胞,non-pretreated组用含1 mmol/l布比卡因的培养液处理细胞。各组细胞在布比卡因处理3h后用FCM分析细胞内ROS水平,四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5’, 6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazole-carbocyanide iodine, JC-1)检测线粒体膜电位,Western blot法检测p38和p-p38 MAPK蛋白,激光共聚焦显微镜检测线粒体内C1-浓度的变化。各组细胞在布比卡因处理24 h后用MTT法检测细胞存活率,Hoechst33258染色法和FCM检测细胞凋亡。同时,未用布比卡因处理的各组细胞在相同时间点检测上述相同的指标作为对照。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 13.0统计软件分析。细胞ROS含量、C1-荧光强度、线粒体膜电位变化、细胞存活率、细胞凋亡率、p38和p-p38 MAPK蛋白表达量采用两因素析因设计资料方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’s T3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果布比卡因处理后,DIDS组和DIDS+SB203580组细胞内ROS水平低于non-pretreated组(P<0.01)。FCM检测线粒体膜JC-1聚合体／单体荧光强度比值显示,DIDS组和DIDS+SB203580组分别为0.74±0.04和0.76±0.05,均高于non-pretreated组(0.49±0.01),差异均有统计学意义(P<0.01)。激光共聚焦显微镜检测线粒体内C1-浓度显示,DIDS组和DIDS+SB203580组的Cl-浓度均低于non-pretreated组(P<0.01)。Western blot显示,DIDS组和DIDS+ SB203580组的p-p38 MAPK蛋白表达水平均低于non-pretreated组。MTT检测显示,DIDS组和SB203580组的存活率高于non-pretreated组(P<0.01),但均低于DIDS+SB203580组(P<0.05)。FCM检测细胞凋亡率显示,布比卡因处理后DIDS组、DIDS+SB203580组、SB203580组和non-pretreated组分别为31.88±4.41%、26.51±3.56%、33.30±2.01%和39.00±3.18%；SB203580组细胞凋亡率较non-pretreated组低(P<0.01),但细胞内ROS和JC-1聚合体／单体荧光强度比值与non-pretreated组的差异无统计学意义(P>0.05)。Hoechst33258染色法检测显示,经布比卡因处理后DIDS组、DIDS+SB203580组、SB203580组和non-pretreated组的凋亡率分别为33.23±3.00%、28.80±4.69%、34.74±4.24%和43.05±5.26%。结论布比卡因可能通过影响线粒体VDAC通道和激活p38 MAPK途径导致细胞凋亡。布比卡因引起细胞ROS增多后,使线粒体的VDAC通道开放,Cl-进入线粒体内,导致线粒体膜电位降低、通透性增大和p38 MAPK激活。