嗜盐古生菌rad25基因上游序列在三域生物中的启动子功能研究

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利用大肠杆菌启动子探针载体pKK232-8,从极端嗜盐古生菌中基因组DNA分离得到一个能在真细菌域(大肠杆菌)中具有启动子活性的RM10DNA片段。DNA序列查询发现它包含了嗜盐古生菌rad25基因部分编码序列和上游调控序列;DNA序列分析表明该片段既含有类似嗜盐古生菌启动子和真核生物RNA聚合酶Ⅱ启动子的TATAbox特征序列等,也含有典型的真细菌启动子-35和-10区特征序列。 在嗜盐古生菌中,以β-半乳糖苷酶基因(bgaH)为报告基因,构建了RM10片段和报告基因相融合的重组质粒,通过检测报告基因转录的mRNA和表达的酶活性,证明了RM10DNA片段的确具有启动子功能。通过构建了一系列RM10不同缺失片段融合到报告基因上游的重组质粒,检测了RM10不同缺失片段的启动子活性大小,在嗜盐古生菌中浓缩定位了RM10片段中对于启动子活性有影响的重要功能区,结果表明:rad25基因5端上游含有TATAbox和BRE特征序列(-305至-130)是片段中对启动子活性有影响的关键功能区。 在大肠杆菌中,利用氯霉素抗性基因(cat)作为报告基因,构建了RM10片段和报告基因的融合质粒,通过检测报告基因的转录和抗性水平,结果表明RM10片段在大肠杆菌具有启动子功能。通过构建缺失片段插入报告基因上游的重组质粒,在大肠杆菌对RM10片段进行了缺失突变分析,确定了rad25基因5端上游序列包含TATAⅠ特征序列的-305~-250区段是影响RM10片段在大肠杆菌的启动子活性关键部分。结果说明rad25基因5端上游序列在大肠杆菌有启动子功能和在嗜盐古菌中有启动子功能在序列上既存在差异,同时又是相互联系的。 在酿酒酵母菌和哺乳动物细胞中,分别利用G418抗性基因(neor)、绿色荧光蛋白基因(egfp)、荧光素酶基因(Luc+)为报告基因,构建各种RM10片段和报告基因相融合的重组质粒,通过检测报告基因表达的抗性水平、绿色荧光和酶活性,证实RM10在真核生物中具有启动子功能。通过构建缺失片段融合到报告基因上游的重组质粒,对RM10片段进行了缺失突变分析,结果表明:在酿酒酵母中,含有TATAⅣ和多个GGCGGbox特征序列的-1767~-889区段对RM10片段在酵母菌中具有强启动子活性很重要,包含TATAⅢ特征序列的-889~-403区段是RM10片段在酵母菌中有启动子活性的基本的区段,包含TATAⅡ特征序列的-403~-329区段对RM10片段在酵母菌中有启动子活性有一定影响。在动物细胞中,含有TATAⅢ、TATAⅡ和TATAⅠ特征序列的+1~-889区段启动子活性最大,含有TATAⅢ特征序列的-889~-403区段、TATAⅡ特征序列的-403~-305区段、和TATAⅠ特征序列的-305~-197区段每段都对RM10片段在细胞中有启动子活性都有非常重要的影响。在每种真核细胞中,其启动子活性与推测的真核启动子特征序列基本上是一致的,在不同的真核细胞中,其主要功能区既存在差异又是相互联系的。 将精确、灵敏、快捷的微量量热方法应用于启动子的结构与功能研究,进一步证实了RM10片段在酵母和大肠杆菌中的启动子功能,获得了一系列的动力学和热力学参数,分析了这些参数与启动子功能的关系,热化学研究结果与生物学的研究结果相一致,充分体了化学与生物学学科交叉的优势。
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