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目的:黄连(Rhizoma Coptidis)为毛茛科植物黄连、三角叶黄连或云连的干燥根茎。黄连作为降脂药物一直被广泛应用于临床治疗上。现代药理研究表明,黄连及其生物碱的降血脂机制主要有:增强胰岛素受体表达,降低血糖同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成;降低胰岛素抵抗、提高胰岛素的敏感性;延长低密度脂蛋白受体m RNA半衰期,增加LDLR表达量;降低机体炎症反应,缓解肥胖症状;提高机体抗氧化水平,改善高血脂症状。在肝脏与脂代谢相关的众多信号通路中,胆汁酸膜受体TGR5(G蛋白偶联受体)和胆汁酸核受体FXR-α吸引了研究者的极大关注。最新研究发现,天然或人工合成的胆汁酸受体激动剂在控制血脂、治疗糖尿病、粥样动脉硬化等代谢异常疾病方面具有良好应用前景。目前,天然的胆汁酸受体激动剂只有关于齐墩果酸的报道。开发以胆汁酸信号通路为靶标的药物,不仅有助于治疗肥胖症、糖尿病、血脂异常等代谢性疾病,对炎症反应、肿瘤等疾病的治愈也大有裨益。本课题组前期研究发现,口服黄连生物碱的生物利用率小于5%,药物主要分布大鼠的肝脏、肠道、脑和肺,大部分药物最终经肠道随粪便排出体外。因此我们推测:黄连生物碱之所以有较好的降脂效果,一方面是由于部分药物进入血液后影响了肝脏脂质代谢相关通路进而降低了血脂;另一方面是经肠道吸收和排泄的黄连生物碱可作用于肠道微生物,改善血脂水平。尚未见国内外报道黄连生物碱能否通过影响胆汁酸受体通路来发挥调节血脂异常的作用。因此,本研究拟以C57BL/6J小鼠为模型,采用分子生物学和微生物组学技术研究黄连生物碱通过影响胆汁酸受体通路和肠道微生物来改善动物血脂水平的效果和机制。方法和结果:(1)研究黄连生物碱对高脂高胆固醇饮食诱导高血脂C57BL/6J小鼠血脂水平的影响。结果发现,与正常对照组相比,高脂高胆固醇(HFHC)饮食导致C57BL/6J小鼠血清中TC、TG、LDL-C,TBA和LPS显著增加。140 mg/kg×day的巴马汀,黄连碱,小檗碱和黄连总生物碱(TRAC)灌胃35天能显著降低小鼠血清中TC、TG、TBA和LPS含量的水平。与HFHC组相比,小檗碱、黄连碱、巴马汀和黄连总生物碱(TRCA)治疗的小鼠血清TC显著降低了41.5%、48.3%、45.3%和47.5%。与之伴随的是黄连碱和TRCA处理组中LDLC含量分别降低了11.2%和12.9%(P<0.05)。黄连碱、巴马汀和TRCA治疗的小鼠血清TG显著降低32.1%、37.2%和40.1%(P<0.05)。血清HDLC水平在各治疗组有上升趋势,但与模型组相比无显著差异。此外,在小檗碱、黄连碱、巴马汀和TRCA给药后,肥胖小鼠的LPS含量分别显著降低了32.4%、42.3%、31.0%和45.1%。(2)肝脏组织切片油红O染色检测黄连生物碱对C57BL/6J小鼠肝脏脂肪沉积的影响;附睾脂肪组织HE染色检测黄连生物碱对脂肪细胞大小的影响。定量分析显示,与高脂模型小鼠相比,灌胃巴马汀、黄连碱、小檗碱和TRAC分别减少了28.1%、24.9%、21.2%和26.7%的肝脏甘油三酯含量,并将脂肪细胞大小降低了37.2%、17.4%、15.6%和22.9%。(3)黄连生物碱对C57BL/6J小鼠肝脏与脂代谢相关靶标m RNA和胆汁酸受体通路相关蛋白表达的影响。QPCR结果发现,灌胃黄连生物碱能够逆转高脂高胆固醇饲料喂养对FAS、TXNIP、GOT2、APOA4、FXR、EEF1B2、HMGCR、CYP7A1、SREBP2、LDLR、TGR5、ASBT和CYP8B1的m RNA表达的影响。Western blot对胆汁酸和SREBPs通路相关蛋白的表达情况检测发现,与模型组相比,黄连碱、小檗碱、巴马汀和TRCA能激活胆汁酸受体FXR,提高SREBP2、LDLR、CYP7A1、ASBT等相关蛋白表达水平,能不同程度的抑制HMGCR和TXNIP的表达。(4)黄连生物碱对C57BL/6J小鼠小肠与炎症反应相关蛋白靶标的影响。机体持续的炎症反应是肥胖症的另一个特征。本研究表明与模型组小鼠相比,黄连生物碱治疗显著降低了小鼠附睾脂肪中炎症因子JNK和TLR4的表达。在回肠中,TLR4和COX2的表达在高脂血症小鼠中升高,黄连生物碱治疗同样降低了小鼠回肠中这两种细胞炎症因子。(5)黄连生物碱对C57BL/6J小鼠体内胆汁酸肝肠循环的影响。高脂高胆固醇饮食导致小鼠血清和肝脏中的胆汁酸含量升高,黄连生物碱能有效降低小鼠血清中的胆汁酸,增加粪便中的胆汁酸含量。机理研究显示,黄连生物碱能显著提高肝脏中胆汁酸合成限速酶-CYP7A1的表达;可上调负责将胆汁酸从肝细胞转运到胆管系统的BSEP的表达。在回肠中,黄连生物碱显著增加了ASBT的表达,使得胆汁酸的重吸收量增加,最终这些胆汁酸被转运回肝脏。上述生理变化促进了胆汁酸的肠肝循环和脂质消化。此外,黄连生物碱显著降低了小鼠回肠中的紧密连接蛋白Occludin和Claudin 1的表达,使肠道通透性增加,进而促进了胆汁酸的粪便排泄,降低了高血脂小鼠体内的脂质含量。(6)黄连生物碱对C57BL/6J小鼠肠道菌群的影响。使用16S r RNA基因测序方法,检测高脂高胆固醇饮食和黄连生物碱对小鼠肠道菌群的影响。从32个粪便样品获得了144218个可用的焦磷酸测序读数,总共鉴定了106种微生物。结果发现HFHC组小鼠体内检测到的微生物总数均低于正常模型组和给药组小鼠。表明黄连生物碱治疗避免了肥胖小鼠肠道微生物的多样性下降,且有利于在HFHC饮食动物体内维持稳定和健康的细菌群落。在种水平上,本研究首次报道了黄连生物碱治疗能明显降低Desulfovibrio C21_c20、Parabacteroides distasonis和大肠杆菌在高血脂小鼠肠道内的丰度;相反,小檗碱、黄连碱、巴马汀和TRCA显著增加了小鼠肠道内Akkermansia muciniphila,Sporobacter termitidis和Alcaligenes faecalis的丰度。基于Uni Frac法聚类分析的结果同样证明黄连生物碱能够恢复由高脂高胆固醇饮食所造成的肠道微生物菌群失衡。(7)微生物与细胞共培养模型的构建及肠道微生物在脂代谢中作用探讨。建立了细胞和肠道微生物共培养模型,结果显示Alcaligenes faecalis和Escherichia coli与肝癌细胞共培养能对细胞中的脂质代谢相关蛋白的表达产生“相似而又不同”的作用。即Alcaligenes faecalis和Escherichia coli都能影响Hep G2细胞中的脂代谢相关蛋白表达。然而,这两种细菌对相同靶标的影响作用则差异很大。Escherichia coli细菌能剂量依赖性地将CYP7A1、ASBT的表达提高。而Alcaligenes faecalis显示出相反的趋势。Alcaligenes faecalis和Escherichia coli共培养均提高了Hep G2细胞中的FXR水平,但两种菌株的FXR上调活性随浓度的增加而降低。此外,Escherichia coli剂量依赖性地抑制了Hep G2细胞中LDLR和HMGCR的表达。三种浓度下的Alcaligenes faecalis显着降低了HMGCR水平。至于SREBP2,只有Escherichia coli能提高该蛋白的表达,在相同条件下用Alcaligenes faecalis共培养对该靶标的表达几乎没有影响。这些结果证实肠道微生物能够直接影响肝细胞与脂质代谢相关蛋白的表达,进而对体内的糖脂代谢产生影响。结论:本研究首次证实黄连生物碱可促进胆汁酸受体FXR和TGR5表达,其降脂机制可通过激活胆汁酸受体通路相关蛋白,促进胆汁酸肝肠循环,改善机体炎症水平及调节肠道微生物菌群来实现。