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研究背景我国食管癌因其发病率高、侵袭性强及预后差等特点对人们的健康和生活有着严重的威胁和影响。我国食管癌高发多有区域性聚集现象,比较常见的地域在河南林县、河北磁县和涉县、山西长治地区太行山脉以及山东、山西、陕西等地区,且多发生在食管上段和中段,病理类型与欧美国家存在明显差异,我国以鳞癌为主要病理类型。食管癌起病隐匿,我国食管癌患者就诊时即为局部晚期或晚期的,占总患病人口的75%,手术治疗效果欠佳。目前针对晚期食管癌的一线治疗方案是同步放化疗,具有较好的局部控制率并提高患者生存期。但在肿瘤组织中普遍存在放化疗抗拒的癌细胞,使得肿瘤局部控制率下降,从而难以达到根治的治疗目的。目前,已上市的抗血管生成药物在抑制血管生成方面有了一定的效果,但同时也有许多不足之处,比如:1.耐药性强;2.特异性低;3.出血、穿孔等风险高;4.疗效欠佳;因此,晚期食管鳞癌可选择的治疗药物有限,到目前为止,食管癌仍无有效的分子靶向药物。盐酸安罗替尼（Anlotinib Hydrochloride,AL3818）是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂,能够靶向抑制经典的HIF-VEGF血管生成信号通路,同时能够靶向抑制c-Kit等细胞增殖信号通路,具有双重抗肿瘤作用。临床研究证实,安罗替尼对多个瘤重具有显著疗效,且不良反应数据显示其安全性良好、毒性可耐受。但在食管癌的研究中,仅有罕见报道晚期食管癌的单药维持治疗,可供参考数据少,疗效有限。本课题重点探讨安罗替尼与放疗联合应用时增敏食管鳞癌治疗疗效的作用及机制。实验目的1.临床研究观察安罗替尼8mg每日一次（QD）联合放化疗治疗食管鳞癌术后淋巴结复发患者的安全性及有效性;2.构建裸鼠食管癌皮下抑制瘤模型,探索安罗替尼对食管鳞癌的抑瘤及对放疗的增敏作用;3.通过对肿瘤血管形态的测定,明确安罗替尼对肿瘤血管正常化的影响,寻找血管正常化窗口期;4.利用乏氧探针,探索肿瘤血管正常化时间窗内肿瘤组织乏氧改善的情况;5.构建3D共培养体系,通过血管形成实验探索安罗替尼促进血管正常化的机制;6.再次通过体内实验,寻找安罗替尼增敏放疗的机制,可能为血管正常化;7.最终,为安罗替尼增敏食管鳞癌放疗疗效的临床转化提供更多依据。实验方法1.临床所得数据均采用数值、百分率（%）表示,连续变量用中位数表示;2.建立食管癌异体皮下移植瘤:在培养皿中培养人食管癌Eca109细胞,待细胞处于对数生长期时,确定细胞活力在90%以上,制成单细胞悬液,在无菌条件下以0.2ml/只接种于BALB/C裸鼠皮下（细胞浓度为5×107/ml,）,接种部位位于裸鼠肩胛骨内侧皮下,待肿瘤体积长出约为100-300mm3时备用;3.利用构建的裸鼠食管癌移植瘤模型,观察安罗替尼对食管鳞癌的抑瘤及对放疗增敏的作用;4.利用CD31、NG2、CollagenⅣV作为内皮细胞、周细胞、基底细胞的标志物,寻找血管正常化时间窗;5.利用乏氧探针（HypoxyprobeTM Kit）及免疫荧光染色,观察血管正常化时间窗内肿瘤乏氧情况;6.通过在血管正常化时间窗内、外放疗,对比肿瘤瘤体缩小情况;7.利用TUNNEL免疫荧光染色对比时间窗内、外放疗,肿瘤组织内凋亡情况;8.利用CellCountingKit-8法（CCK-8）及划痕实验检测不同浓度安罗替尼对食管癌细胞增殖、存活和迁移能力的影响;9.利用细胞3D共培养构建体外三维细胞培养模型,模拟血管形态,观察经安罗替尼处理后,血管形成情况。实验结果1.入组10例患者均为食管鳞癌术后淋巴结复发,近期疗效较既往报道的ORR及DCR均有提高,提示安罗替尼联合同步放化疗治疗食管鳞癌术后复发患者安全性可耐受;2.与对照组相比,安罗替尼组的肿瘤体积生长缓慢,第11天瘤体体积有下降趋势,安罗替尼有抑制肿瘤生长的作用;3.与对照组相比,安罗替尼处理后肿瘤血管内皮分布更均匀、成熟周细胞的比例增加、基底膜增厚程度下降,与周围细胞组织连接紧密度增高,经统计后得出:安罗替尼血管正常化时间窗为5-7天;4.对照组乏氧第5-14天逐渐改善,第21天再次乏氧,肿瘤增大过程中,瘤体组织乏氧富氧存在周期性变化;安罗组在第3-7天乏氧改善,之后通过抑制血管生成起到抑瘤作用;5.在血管正常化时间窗内、外对移植瘤放疗,观察五组移植瘤瘤体大小,发现血管正常化时间窗内放疗,肿瘤瘤体退缩明显;6.通过TUNEL荧光标记下的凋亡颗粒,观察与单纯用药组比较,在血管正常化窗口期内放疗,瘤体内细胞凋亡最显著;7.安罗替尼浓度＞100μM时,食管癌细胞存活数量显著下降,毒性太大;浓度小于50μM,食管癌细胞的活力会随安罗替尼浓度的增高呈梯度下降;摸索得出安罗替尼浓度在20、40μM处理后,细胞增殖减少;8.利用3D共培养体系,通过计算周细胞的覆盖率,发现经安罗替尼处理后可以减弱肿瘤微环境下的血管形成,随着浓度的增加,这种作用越强;发现20μMAL3818浓度下的肿瘤微环境,血管正常化组显著。结论1.安罗替尼联合同步放化疗治疗食管癌术后淋巴结复发患者时,副反应可耐受,安全性可耐受。2.安罗替尼能抑制肿瘤血管生长,促进肿瘤血管正常化,且具有抑瘤作用;3.安罗替尼可以促进血管正常化,时间窗内联合放疗,增敏效果最显著;4.在使用安罗替尼的初始阶段,由于“异常血管正常化”机理,第5-7天出现“氧合时间窗”,可增敏放疗,此阶段肿瘤组织内乏氧得到改善,发挥安罗替尼和放射治疗的协同效用;5.在使用安罗替尼的后期阶段,由于抗血管作用,肿瘤内血管退化、内部乏氧加重,放疗敏感性下降,此阶段发挥更多的是安罗替尼抑瘤和放疗两种治疗的叠加抑瘤效应;