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背景和目的肺癌是目前发病率较高的恶性肿瘤,随着环境污染的加重,肺癌的发病率和死亡率还在呈明显上升的趋势,严重威胁人民的生命健康。中医药在治疗肿瘤方面已经取得了相当大的成就,尤其是开发植物的中草药中提取的抗癌有效组分。分析各种中医药的化学结构式以及从他们之中提取抗肿瘤有效活性成分是当前研究方向。同时也有大量文献报道指出,没食子酸在肿瘤的临床应用中具有诸多药理活性,如没食子酸能通过降低细胞中的自由基的含量从而提升细胞的抗氧化能力;同时没食子酸能通过促进肿瘤细胞的凋亡过程和肿瘤内密集的滋养新生血管的形成,从而抑制肿瘤的形成和进一步转移、恶化等,但其具体机制尚不明确。因此,本研究以没食子酸对肺癌细胞增殖和凋亡的活性及可能机制为突破点,从而为进一步的开发肺癌治疗的天然药物提供理论依据和技术支持。本课题分为三个部分:第一部分通过细胞实验观察没食子酸对肺癌细胞A549和95-D增殖和凋亡的影响;第二部分采用建立裸鼠体内成瘤模型,观察没食子酸对体内肿瘤生长的影响,并检测体内肿瘤组织中肺癌细胞A549和95-D增殖情况;第三部分通过没食子酸与肺癌细胞A549和95-D混合培养,应用Westernblot法检测观察A549和95-D中NF-κβ蛋白、Caspase-3蛋白、AKT总蛋白及AKT磷酸化蛋白和P53蛋白的表达来了解没食子酸引起肺癌细胞凋亡的可能机制。第一部分细胞实验情况下没食子酸对肺癌细胞A549和95-D增殖和凋亡的影响1.不同浓度没食子酸溶液、A549及95-D细胞培养液的配制。2.用CCK-8法检测A549及95-D两种肿瘤细胞的增殖情况。3.应用流式细胞实验检测A549及95-D两种肿瘤细胞的细胞周期。4.应用流式细胞实验检测A549及95-D两种肿瘤细胞的细胞。5.统计学方法:应用SPSS19.0系统分析实验中的所有实验数据,两组数据之间比较应用t检验,三组及以上数据进行比较应用χ2检验,同时应用卡方检验法检测百分占比的计数资料。结果1.没食子酸浓度在10μg/m L时,肺癌细胞A549和95-D的增值情况与空白组(没食子酸为0μg/m L)相比无显著差异,p>0.05;在没食子酸浓度在20、30μg/m L时,肺癌细胞A549和95-D增殖受到抑制,较空白组(没食子酸为0μg/m L)的抑制率显著升高,p<0.05差异显著;且当没食子酸浓度>10μg/m L时,随着没食子酸浓度的升高,肺癌细胞A549和95-D的增殖抑制率显著升高,p<0.05,差异显著。2.与空白组相比(没食子酸为0μg/m L),20μg/m L和30μg/m L没食子酸可使同一视野下的肺癌细胞A549和95-D生长数目显著减少,p<0.05差异显著;而10μg/m L没食子酸与空白组差异不明显,p>0.05;随着对没食子酸浓度的提升,肺癌细胞A549和95-D的凋亡状态的细胞逐渐增多。3.与空白组相比,10、20、30μg/m L没食子酸可使肺癌细胞A549和95-D的细胞周期更多停留在G0/G1期(差异显著,p<0.05);且随着没食子酸浓度的升高,肺癌细胞A549的细胞周期停留在G0/G1期比例显著提高,而S期和G2/M期比例显著下降(差异显著,p<0.05)。4.随着没食子酸浓度的升高,肺癌细胞A549的细胞早期凋亡率也显著增高(其中p<0.05,差异显著,有统计学意义);在肺癌细胞A549的细胞晚期凋亡率中,各剂量组没食子酸对肺癌细胞A549的细胞晚期凋亡率影响上无显著差异,p>0.05,无统计学意义,在肺癌细胞A549的细胞总凋亡率(早期+晚期凋亡率)中,随着没食子酸浓度的升高,肺癌细胞A549的细胞总凋亡率(早期+晚期凋亡率)也显著增高(其中p<0.05,差异显著,有统计学意义)。在肺癌细胞95-D的细胞早期凋亡率中,0μg/m L和10μg/m L没食子酸对肺癌细胞95-D的细胞早期凋亡率影响上无显著差异,p>0.05,无统计学意义,然而当没食子酸浓度>10μg/m L后,随着没食子酸浓度的升高,肺癌细胞95-D的细胞早期凋亡率也显著增高(其中p<0.05,差异显著,有统计学意义);随着没食子酸浓度的升高,肺癌细胞95-D的细胞晚期凋亡率显著增高(其中p<0.05,差异显著,有统计学意义);在肺癌细胞95-D的细胞总凋亡率(早期+晚期凋亡率)中,随着没食子酸浓度的升高,肺癌细胞95-D的细胞总凋亡率(早期+晚期凋亡率)也显著增高(其中p<0.05,差异显著,有统计学意义)。第二部分没食子酸对A549和95-D体内成瘤能力的影响方法1.应用A549和95-D单细胞浑浊液在SPF级裸鼠右前肢腋下区造模,建立动物。2.造模成功后分别分为空白组和没食子酸给药组,动态观察肿瘤体积变化,制作肿瘤相对体积生长曲线,并计算抑癌率。3.应用免疫组化法检测切下的大体标本肿瘤组织中A549和95-D的增殖指数。4.统计学方法:应用SPSS19.0系统分析实验中的所有实验数据,两组数据之间比较应用t检验,三组及以上数据进行比较应用χ2检验,同时应用卡方检验法检测百分占比的计数资料。结果1.在没食子酸治疗2周后,裸鼠+A549+没食子酸给药组(30μg/m L)相对肿瘤体积较裸鼠+A549+空白对照组显著降低(p<0.05,差异显著,有统计学意义),裸鼠+95-D+没食子酸给药组(30μg/m L)相对肿瘤体积较裸鼠+95-D+空白对照组显著降低(p<0.05,差异显著,有统计学意义)。通过称量各组小鼠肿瘤的重量可得出,裸鼠+A549+空白对照组、裸鼠+A549+没食子酸给药组(30μg/m L)、裸鼠+95-D+空白对照组、裸鼠+95-D+没食子酸给药组(30μg/m L)、的肿瘤重量分别为6936.5±831.5mg、2135.9±521.4mg、4556.7±689.3mg、862.3±106.7mg,其中没食子酸(30μg/m L)对A549体内成瘤抑制率为69.21%,没食子酸(30μg/m L)对95-D体内成瘤抑制率为81.08%。2.裸鼠+A549+没食子酸给药组(30μg/m L)具有增殖能力的肿瘤细胞数明显少于裸鼠+A549+空白对照组;裸鼠+95-D+没食子酸给药组(30μg/m L)具有增殖能力的肿瘤细胞数明显少于裸鼠+95-D+空白对照组(差异显著,p<0.05)。3.计算肿瘤增殖指数,裸鼠+A549+没食子酸给药组(30μg/m L)肿瘤增殖指数0.1835±0.0186明显少于裸鼠+A549+空白对照组0.2962±0.0216(差异显著,p<0.05);裸鼠+95-D+没食子酸给药组(30μg/m L)肿瘤增殖指数0.0932±0.0109明显少于裸鼠+95-D+空白对照组0.2268±0.0207(差异显著,p<0.05)。4.统计学方法:应用SPSS19.0系统分析实验中的所有实验数据,两组数据之间比较应用t检验,三组及以上数据进行比较应用χ2检验,同时应用卡方检验法检测百分占比的计数资料。第三部分没食子酸诱导细胞凋亡的可能机制研究方法1.应用不同浓度的没食子酸于肺癌细胞A549和95-D培养液混合培养。2.应用Westernblot方法检测A549和95-D细胞核中NF-kβ蛋白的表达。3.应用Westernblot方法检测A549和95-D细胞Caspase-3蛋白的表达。4.应用Westernblot方法检测A549和95-D细胞中AKT总蛋白和AKT磷酸化蛋白的表达。5.应用Westernblot方法检测A549和95-D细胞中P53蛋白的表达。6.应用si RNA进行转染,敲低P53蛋白后观察没食子酸对A549和95-D细胞Caspase-3蛋白的表达的影响。7.采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。结果1.随着没食子酸浓度的增加,肺癌细胞A549和95-D中NF-κβ蛋白表达量显著降低(p<0.05,差异显著,有统计学意义)。2.随着没食子酸浓度的增加,肺癌细胞A549和95-D中Caspase-3蛋白表达量显著增加(p<0.05,差异显著,有统计学意义)。3.随着没食子酸浓度的增加,肺癌细胞A549中AKT总蛋白表达量没有显著变化(p>0.05,差异不显著,无统计学意义);肺癌细胞A549中AKT磷酸化蛋白表达量显著降低(p<0.05,差异显著,有统计学意义)。结论1.没食子酸能抑制肺癌细胞增殖,促进肺癌细胞凋亡,且与没食子酸浓度呈剂量依赖关系。2.没食子酸能抑制肺癌细胞A549和95-D的体内成瘤能力。3.没食子酸能通过抑制肺癌细胞中NF-κβ蛋白、AKT磷酸化蛋白表达,促进肺癌细胞Caspase-3蛋白、P53蛋白的表达来影响肺癌细胞的凋亡过程。4.敲低p53基因后发现没食子酸激活下游凋亡蛋白caspase3减少,表明p53基因可能是没食子酸诱导肺癌细胞凋亡的关键蛋白。