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氮氧自由基化合物是一类稳定的自由基化合物,它们具有分子量小、水溶性、膜通透性和金属非依赖性类超氧化物歧化酶作用等特点。氮氧自由基可抑制氧自由基和羟自由基的形成,减轻NO、硝酰基、过氧亚硝酸盐引起的氧化应激,发挥抗氧化损伤和辐射保护作用。然而另一方面,氮氧自由基化合物通过促进氧化作用,可抑制多种肿瘤细胞生长。Tempol是氮氧自由基的代表,它通过细胞色素p450系统增加肿瘤细胞内H2O2的含量产生促氧化作用,选择性抑制肿瘤细胞的生长,并表现出抗肿瘤效果。本实验研究了一种新合成的氮氧自由基化合物（左旋苯甲酸脯氨醇,L-NNP）对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的细胞毒性及其作用机理。首先,研究不同浓度和暴露时间L-NNP的细胞毒性和它的作用靶点。采用MTT和细胞克隆形成实验检测细胞存活;用流式细胞仪检测细胞周期和细胞死亡;用Janus green B和Hoechst 33258染色观察细胞形态,用透射电镜观察细胞超微结构;用LDH释放实验和PI摄取实验检测细胞膜的损伤;用琼脂糖凝胶电泳、单细胞电泳和γ-H2AX免疫荧光检测DNA双链断裂;用流式细胞仪和荧光显微镜分别检测细胞内活性氧水平和线粒体膜电位的变化;采用生化实验检测细胞内脂质氧化、抗氧化能力以及线粒体氧化呼吸链功能的变化。结果发现L-NNP明显抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的生长,对MDA-MB-231细胞的细胞毒性明显大于MCF-7细胞。相同浓度的的L-NNP（50μg/ml）对两种乳癌细胞的杀伤明显大于阳性对照药Docetaxel,而且效应随L-NNP浓度升高和暴露时间延长而增加。L-NNP对乳癌细胞周期有双相影响,包括短暂、轻度的G1阻滞和迟发显著的S期阻滞。形态学观察显示L-NNP暴露48 h可诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞发生典型的胀亡改变,细胞明显肿胀伴细胞结构破坏。L-NNP诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞出现膜结构破坏、DNA双链断裂和线粒体结构功能丧失。生化实验检测结果表明细胞内ATP减少、MDA增加、细胞内抗氧化能力下降,表明L-NNP引起细胞氧化应激和氧化损伤。而且L-NNP引起两种乳腺癌细胞内活性氧含量显著增加,并随其浓度升高和暴露时间延长而增加。由此我们推测L-NNP可能是通过显著增加细胞内活性氧水平引发氧化损伤导致细胞胀亡。为了验证我们的推测,选用活性氧清除剂NAC进行实验探讨L-NNP诱导MCF-7细胞胀亡的机制。L-NNP处理MCF-7细胞6 h前先用10 mM NAC处理1 h,用流式细胞仪检测细胞内活性氧水平的变化;用10 mM NAC和L-NNP共同处理MCF-7细胞48 h后分别用MTT检测细胞活力、Janus green B和Hoechst33258染色检测细胞形态的变化;此外检测L-NNP对MCF-7细胞内Caspases-3活力的影响;用免疫印迹法评价MCF-7细胞内p53、Bax、Porimin、NF-κB和Bcl-2蛋白表达的变化。结果发现NAC可显著减少L-NNP引起的MCF-7细胞内活性氧的增加。NAC和L-NNP共孵育后MCF-7细胞存活率明显高于L-NNP组,而且细胞形态正常,进一步证明细胞内活性氧水平在L-NNP介导的胀亡中起着重要作用。研究还发现L-NNP抑制MCF-7细胞内Caspase-3的活力并下调p53和Bax蛋白表达,但是L-NNP可诱导NF-κB p65和Bcl-2的蛋白表达水平升高,NAC则可明显抑制L-NNP诱导的NF-κBp65和Bcl-2蛋白增加。更重要的是NF-κB的特异性抑制剂Bay-11-7082可抑制L-NNP诱导的NF-κBp65和Bcl-2蛋白表达增加。由此可见细胞内活性氧增加可能是L-NNP细胞毒性的始动因素,它继而激活了Caspase非依赖性的NF-κB/Bcl-2通路,最终诱导细胞发生胀亡。然后我们采用人类基因表达谱芯片、实时荧光定量PCR、免疫印迹和ELISA方法检测L-NNP诱导的MCF-7细胞胀亡早期有哪些基因的转录水平和蛋白表达量发生了改变。结果发现30μg/ml L-NNP处理6 h组与对照组相比,上调基因26个,下调基因74个。其中ACCN2、S100A6、IGF-1的mRNA转录水平和蛋白表达均上调,说明ACCN2、S100A6、IGF-1蛋白参与了L-NNP诱导的MCF-7细胞胀亡的早期反应。ELISA检测表明L-NNP处理组IL-2、IL-4、IL-10含量增加随L-NNP浓度升高和暴露时间延长而增加,我们推测L-NNP诱导的细胞内活性氧增加引起NF-κB上调,继而诱导细胞因子的升高,参与或调节细胞胀亡的过程。为了进一步研究L-NNP的抗肿瘤作用,我们将人肝癌HepG2细胞皮下接种于裸鼠,观察了L-NNP对移植瘤的生长和裸鼠生存期的影响。结果发现,与2mg/ml氟尿嘧啶相比,4 mg/ml L-NNP可延长荷瘤裸鼠的生存期,2 mg/ml L-NNP可部分抑制移植瘤的生长。综上所述, L-NNP在细胞和动物水平均具有一定的抗肿瘤作用,主要通过活性氧介导的氧化损伤,激活Caspase非依赖的NF-κB/Bcl-2通路,作用于细胞膜、线粒体和DNA,引起细胞结构和生物大分子破坏,最终导致肿瘤细胞胀亡。该实验研究为肿瘤化学治疗提供了一种高效低毒的候选药物,也为进一步深入研究其抗肿瘤作用、临床应用奠定了基础。