儿茶酚类物质作为重要的化学试剂广泛地被应用于制药工业、化工、化妆品、杀虫剂和染料中,并随着人类的生活和生产活动被释放在水和土壤中,造成了严重的环境污染。外二醇双加氧酶（Extradio dioxygenases,EDOs）广泛存在于芽孢杆菌、假单胞菌和产碱菌等微生物中,可以催化儿茶酚类污染物中与羟基相邻的C-C键的断裂,是酚类污染物的生物降解途径中最重要的酶。目前,已报道的双加氧酶多是常温酶,与常温酶相比,嗜热酶在温度耐受、抗化学物质变性、抗蛋白水解方面表现更优越,更具有工业应用潜力。因此,获得高性能、高稳定性的嗜热双加氧酶具有重要的研究价值。本论文分别从不同嗜热微生物中克隆表达出4种不同的嗜热双加氧酶。经筛选得到高活性的Tcu3516,并对其酶学性质进行了表征。此外,通过对Tcu3516进行同源建模,并与底物分子对接,动力学模拟了解该酶与底物的作用方式。并在此基础上,通过半理性设计对其催化口袋末端的环结构进行改造,获得性能良好的突变体。然后,将酶用于催化不同链长的酰基儿茶酚类底物,以期获得可作为生物塑料前体的烃基不饱和脂肪酸,并对催化反应条件进行了优化。最后,将酶用于催化降解含长链和超长链酰基儿茶酚类底物,并再次通过计算机模拟设计突变位点以减小空间位阻,从而提高酶对酰基儿茶酚的催化能力。论文主要研究内容和结果如下:1.利用NCBI数据库和生物信息学分析,从嗜热微生物中筛选出4种新型嗜热外二醇双加氧酶,成功克隆并表达来源于Thermomonospora curvata DSM43183、Rubrobacter xylanophilus、Sulfolobus islandicus REY15A和Thermobispora bispora DSM 43833的外二醇双加氧酶,并分别命名为Tcu3516、Rxy5255、Si0380和Tbi2513。通过酶活力筛选,获得了高表达、高活力的新型嗜热外二醇双加氧酶Tcu3516。2.通过对Tcu3516序列相似性分析,发现其属于邻氧螯合家族（VOC）/Ⅰ型,且该酶与已报道的其他双加氧酶的序列一致度仅为25-44%。经过系统发育树分析进一步证明,该酶属于独特分支的、尚未被研究的双加氧酶。酶学性质表征表明,该酶最适温度为50℃,最适p H为9.0。且在55℃时,该酶仍具有良好的热稳定性。动力学数据表明该酶具有很好的催化效率。3.Tcu3516具有更广泛的底物适应性,对多种天然底物,包括儿茶酚、3-甲基儿茶酚、3-氯儿茶酚、4-氯儿茶酚、2,3-二羟基邻苯二酚和3,4-二羟基苯基乙酸均有催化能力,这正是处理多种酚类环境污染物所需的性质。通过计算机辅助的同源建模和底物分子对接分析,为了进一步拓展Tcu3516的底物适应性,对Tcu3516催化口袋末端入口处loop环上的较大氨基酸残基进行定点突变,得到3个突变体F301V、D285A和H205V。经检测,上述突变体对于不同的儿茶酚类底物的催化活性均明显提高,其中D285A的酶活力提高了2-17倍。结合酶促反应动力学结果进一步表明,催化口袋末端的环对酶底物特异性和催化效率有着重要的影响。4.Tcu3516能够催化中链酰基儿茶酚1-（2,3-二羟基苯基）-丁烷-1-酮的降解,得到作为可降解生物塑料的前体物质酮基/羟基不饱和脂肪酸。通对催化反应温度、溶剂、时间等条件的优化,确定在反应温度为30℃,溶剂为含10%DMF的磷酸钠缓冲液,空气中反应10小时可达到较高的总转化数（TTN）。Tcu3516对长链酰基儿茶酚和超长链酰基儿茶酚也具有催化能力,但其催化效率有限。为了提高其催化效率,通过酶与底物的分子对接,筛选了减少酶分子对酰基链的空间位阻的突变位点,成功构建了4个突变体R256A、M173A、W292V和D262A突变体。对已获得的7个突变体的性质分析结果表明,位于盖子结构的F301V对于中链酰基儿茶酚和超长链酰基儿茶酚的催化能力均强于野生型。此结果说盖子结构的调整也可提高酶对大底物的催化作用,因而盖子结构具有重要作用。简言之,本研究经筛选得到了新的嗜热外二醇双加氧酶Tcu3516,并构建了高催化活性的突变体,在生物降解酚类污染物及合成高价值的酮基/羟基不饱和脂肪酸方面具有很高的潜在应用价值。