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前期从烟草叶面分离的一株具有良好生防性能的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Tpb55。本文首先研究了Tpb55对烟草黑胫病菌的抑菌效果,在此基础上将绿色荧光蛋白基因转入Tpb55体内,并成功表达,测定了Tpb55-GFP的生物活性和稳定性。温室试验探究了标记菌Tpb55-GFP在不同深度和位置、不同pH、不同有机质和不同质地类型的土壤中定殖规律。田间试验测定了Tpb55对黑胫病的防控能力,并且采用454高通量技术分析了Tpb55对烟草根际微生态的影响。具体结论如下:1.平板对峙培养显示Tpb55菌株对烟草黑胫病菌的生长具有强烈的抑制作用,可以形成明显的抑菌圈。在电子扫描显微镜下,可以观察到Tpb55对烟草黑胫病菌菌丝形态的产生破坏作用,单个菌丝体破裂、弯曲,形态干瘪、褶皱,原生质泄露,整个菌丝体生长杂乱无序。发酵液经旋转蒸发和乙酸乙酯萃取后,Tpb55发酵液粗提物的EC50数值为0.33 mg/mL。2.温室盆栽试验结果显示,Tpb55菌株、58%的甲霜灵锰锌(1:400)和对照处理后黑胫病病情指数分别为21.44、19.12和71.60,这说明Tpb55菌株具有预防和控制烟草黑胫病的生防潜力。2013年和2014年的田间试验结果显示,Tpb55菌株处理的病情指数分别为21.44和14.23,58%的甲霜灵锰锌的病情指数分别为19.12和11.71,对照病情指数分别为31.55和39.51。虽然Tpb55菌株处理的烟草黑胫病病情指数高于58%的甲霜灵锰锌的病情指数,但是2013年和2014年相应的病情指数差异并不明显。3.使用水母荧光蛋白基因标记Tpb55-GFP菌株。标记菌株Tpb55-GFP与原始菌株Tpb55相比,对烟草黑胫病菌和烟草赤星病菌室内抑菌能力基本一致,均可以形成明显的抑菌圈,二者无明显差异。标记菌株Tpb55-GFP与原始菌株Tpb55对烟草黑胫病菌和烟草赤星病菌的抑菌率菌高于60%,以上结果说明Tpb55-GFP可以用于进行下一步的试验。4.Tpb55-GFP菌株定殖动态结果显示,Tpb55-GFP菌株可以在烟草根际成功定殖,相比于其他不同深度土壤的定殖,Tpb55-GFP在烟草根际具有更强的定殖能力,第30天在根际的定殖密度为3.42?106 cfu/g。激光共聚焦显微镜检测显示Tpb55-GFP菌株首先可以在烟草根部形成生物膜,然后会在烟草细胞之间和维管束组织间分布。不同pH土壤定殖试验结果显示,Tpb55-GFP菌株在pH为6-7中性偏微酸性的土壤中具有更强的定殖能力。不同有机质定殖试验结果显示,Tpb55-GFP菌株在腐熟花生壳的土壤中定殖能力更强,主要原因是其中含有丰富的其生长繁殖所需要的有机小分子物质。不同土壤类型定殖试验结果显示,Tpb55-GFP菌株在2:1(黏土:砂)土壤中定殖能力最强,此类型土壤接近自然界壤土的性质,既有一定的水分和养分的报纸能力,又有一定的空气交换能力。5.454高通量测序表明,在病情发展过程中,对照和处理间不同的细菌种类和数量会有不同的变化。Chao 1、ACE和Shannon指数分析表明,Tpb55处理的样品中细菌多样性和丰富度不断提高且高于对照。Tpb55处理后10 d和22 d,OTU序列数据库中与Tpb55 16S rDNA V1-V3区PCR产物高度同源OTU数目分别为31和45。Tpb55处理的烟草黑胫病病情指数(5.29)显著低于对照(38.52)。施用Tpb55可以提高根围土壤细菌多样性和群落结构稳定性,这是其发挥良好生防作用的重要机制之一。