多裂叶荆芥离体再生体系的建立及Cjhppd基因遗传转化

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多裂叶荆芥为八大祁药之一,具有很高的药用价值。本研究旨在建立多裂叶荆芥离体再生体系和遗传转化体系,为多裂叶荆芥的细胞工程育种和利用基因工程技术进行品质改良奠定基础。并将Cjhppd基因导入多裂叶荆芥获得转基因植株,并对转基因植株的除草剂抗性进行了初步检测。主要试验结果如下:1.以多裂叶荆芥(Nepeta multifida (L.)Briq.)无菌幼苗根、茎段、叶片等作为外植体进行不定芽离体再生,建立了多裂叶荆芥离体快速繁殖体系。研究了不同外植体和附加不同外源激素配比对不定芽离体再生的影响。结果表明,多裂叶荆芥离体再生的最佳外植体为带有叶腋的茎段,诱导不定芽再生的适宜培养基为MS+0.2mg/l NAA+1.0mg/lTDZ,每个外植体产生不定芽数平均为18个。不定芽增殖培养每4周为一个周期,理论年繁殖系数可达1×1812。当不定芽生长至3~4cm时移入生根培养基诱导生根。适宜的生根培养基为MS+0.2mg/l NAA,移栽成活率为53.85%。2.利用含有植物表达载体pBI121/gfp的根癌农杆菌,侵染多裂叶荆芥茎段,经共培养和筛选培养得到抗性再生植株。通过荧光观察和PCR检测,抗性植株基因组含有标记基因gpf,并产生绿色荧光。建立了农杆菌介导的荆芥遗传转化体系。3.按照建立的荆芥转化体系,用含有Cjhppd基因的植物表达载体pGWB2的农杆菌菌株EHA105浸染荆芥茎段,将Cjhppd基因导入荆芥,筛选获得了卡那霉素抗性植株,转化率为14.29%。提取抗性植株叶片基因组DNA进行PCR检测,初步验证Cjhppd基因整合到了转基因植株基因组中。对转基因多裂叶荆芥进行了除草剂DTP的抗性分析,结果表明,在三个不同浓度DTP(50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L)胁迫下转基因多裂叶荆芥叶片白化程度明显弱于野生植株。转基因多裂叶荆芥叶片中的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量明显高于野生型植株。初步断定,转Cjhppd基因的多裂叶荆芥表现出了除草剂抗性。
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