第一部分脊髓神经干细胞分离培养及鉴定研究背景:从小鼠神经组织中可以分离培养出具有自我更新、多向分化能力、以及自我增殖的神经干细胞。研究目的:该研究旨在从C57/BL-6小鼠脊髓中分离培养出具有自我更新、自我增殖、以及多向分化能力的神经干细胞株,根据分析观察其生物学性能,从中筛选出增殖能力活跃、具有定向分化为神经元能力的神经干细胞株,将其作为种子细胞进行后续系列研究。研究方法:该研究采用单克隆细胞无血清培养技术,从小鼠脊髓分离出不同神经干细胞株,传至第3代后,采用细胞免疫荧光技术对其特异性标志物NESTIN进行鉴定,经10%胎牛血清诱导培养七天后,细胞免疫荧光对其分化产物神经元特异性标志物Tuj1、星形胶质细胞GFAP进行鉴定,筛选3株传代能力稳定的神经干细胞株,采用CCK-8法对其增殖能力进行测试,进而筛选出增殖能力最强的神经干细胞进行后期研究。研究结果与结论:显微镜下可见分离出的神经干细胞在培养至第3天形成神经球证实该细胞具有自我更新能力;传至第3代的神经干细胞其特异性标志物NESTIN表达呈阳性结果,结合形态学观察证实提取出的细胞为神经干细胞;经10%胎牛血清诱导分化10天后,Tuj1、GFAP细胞免疫荧光测试结果呈阳性说明神经干细胞可以分化为神经元、星形胶质细胞,证实了神经干细胞具有多向分化能力;3株神经干细胞CCK-8结果测试筛选出增殖能力最强的神经干细胞作为种子细胞进行下一步研究。第二部分体外培养环境下神经营养因子对神经干细胞生物学性能的影响研究研究背景:神经营养因子家族具有神经保护作用,可以促进神经干细胞增殖,并促进诱导神经干细胞分化为神经元的比率。研究目的:该研究旨在体外环境下评估观察脑源性神经营养因子、转化生长因子、睫状神经营养因子对神经干细胞分化、增殖、以及凋亡的作用。研究方法:采用CCK-8法监测脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、转化生长因子对神经干细胞株增殖能力的作用;采用细胞免疫荧光技术检测不同神经营养因子对神经干细胞分化产物神经元特异性标志物β-Tubulin III的表达,荧光显微镜下对其分化产物神经元进行计数,进而筛选出神经元定向诱导能力最强的神经营养因子;DAPI染色法观察不同神经营养因子对神经干细胞自然凋亡比率的作用,筛选出抑制神经干细胞自然凋亡进程最优的神经营养因子。研究结果与结论:细胞免疫荧光结果显示筛选的细胞株Nestin表达呈阳性,进一步证实用于该研究的细胞株为神经干细胞;CCK-8法检测结果显示神经干细胞增殖能力为脑源性神经营养因子处理组明显强于睫状神经营养因子组(P<0.01)大于转化生长因子组(P<0.05)显著高于对照组(P<0.01),说明脑源性神经营养因子在促进神经干细胞增殖能力方面具有较大的优势;神经元计数结果显示转化生长因子处理组显著高于脑源性神经营养因子处理组(P<0.05)小于睫状神经营养因子处理组(P=0.05)显著高于对照组(P<0.01),说明转化生长因子在诱导神经干细胞定向分化为神经元能力方面最具优势;DAPI染色监测凋亡率结果显示脑源性神经营养因子处理组显著低于睫状神经营养因子处理组(P<0.01)小于转化生长因子组(P<0.05)显著低于对照组(P<0.01),说明脑源性神经营养因子在维持神经干细胞正常寿命的效果最佳。第三部分神经营养因子治疗脊髓损伤动物模型的实验研究研究背景:神经营养因子家族具有促进神经功能恢复的作用。研究目的:该研究旨在体内环境下评估观察脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、转化生长因子对脊髓损伤动物模型行后肢功能BBB评分、旋转平衡测试及斜坡实验角度测试、以及病理变性神经元改变方面的作用;进而评估其对脊髓损伤动物模型的治疗作用,并从中筛选出治疗效果最为明显的神经营养因子,为后续研究奠定理论基础。研究方法:采用后肢功能BBB评分评估不同神经营养因子对脊髓半切后小鼠后肢功能的改善作用,筛选出治疗效果最优的神经营养因子;采用旋转平衡测试及斜坡实验角度测试评估不同神经营养因子对脊髓半切后小鼠行为学功能的治疗作用,从中挑选出改善作用最强的神经营养因子;镀银染色观察不同神经营养因子对脊髓半切后神经元的损伤的保护作用,筛选出变性神经元最少的神经营养因子进行后续研究。研究结果与结论:后肢功能BBB评分结果显示脑源性神经营养因子处理组显著高于睫状神经营养因子处理组(P<0.01)高于转化生长因子组(P<0.05)显著高于假手术组(P<0.01),说明脑源性神经营养因子在促进脊髓损伤后后肢功能恢复的能力最高;旋转平衡测试结果显示脑源性神经营养因子治疗组高于睫状神经营养因子处理组(P<0.05)高于转化生长因子组(P<0.01)显著高于假手术组(P<0.01),斜坡实验测试角度结果显示脑源性神经营养因子处理组显著高于睫状神经营养因子组(P<0.01)高于转化生长因子组(P<0.01)显著高于对照组(P<0.01),说明脑源性神经营养因子可以有效促进脊髓损伤后的康复效果;镀银染色变性神经元计数结果显示睫状神经营养因子处理组显著低于转化生长因子组(P<0.05)低于脑源性神经营养因子组(P<0.05)显著低于对照组(P<0.01),说明睫状神经营养因子对脊髓损伤后神经元的保护作用最为明显。第四部分脑源性神经营养因子预处理神经干细胞移植治疗脊髓损伤的研究研究背景:体外神经营养因子预处理对神经干细胞具有动员作用。研究目的:该研究旨在前期研究发现的基础上,对比分析脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、转化生长因子预处理的神经干细胞移植治疗脊髓损伤动物模型的后肢功能评分BBB、转棒平衡测试及斜坡实验角度测试改善作用,以及病理变性神经元改变方面的作用,系统评估神经营养因子预处理神经干细胞移植治疗脊髓损伤的治疗效果。研究方法:细胞免疫荧光技术检测神经干细胞特异性标志物Nestin的表达验证移植预处理细胞为神经干细胞,细胞免疫荧光技术检测移植后宿主体内神经干细胞分化产物神经元(Tuj1)和星形胶质细胞(GFAP)的表达,验证移植后神经干细胞可以在宿主体内存活,并分化为具有生物学功能的神经元及星形胶质细胞;采用后肢功能BBB评分测试不同神经营养因子对脊髓半切后小鼠后肢功能的改善作用,筛选出治疗效果最优的神经营养因子;采用旋转平衡测试及斜坡实验角度测试评估不同神经营养因子对脊髓半切后小鼠行为学功能的治疗作用,从中挑选出改善作用最强的神经营养因子;镀银染色观察不同神经营养因子对脊髓半切后神经元的损伤的保护作用,筛选出变性神经元最少的神经营养因子进行后续研究。研究结果与结论:细胞免疫荧光结果显示筛选的细胞株Nestin表达呈阳性,进一步证实用于该研究的细胞株为神经干细胞;脊髓切片Tuj1、GFAP双染呈阳性结果,说明移植后的神经干细胞可以在宿主体内存活,并分化为具有生物学功能的神经元和星形胶质细胞;后肢功能BBB评分结果显示脑源性神经营养因子预处理组显著高于睫状神经营养因子处理组(P<0.01)高于转化生长因子预处理组(P<0.05)显著高于假手术组(P<0.01);说明脑源性神经营养子在促进脊髓损伤后后肢功能恢复的能力最高;旋转平衡测试结果显示睫状神经营养因子预处理组高于脑源性神经营养因子预处理组(P<0.05)高于转化生长因子预处理组(P<0.01)显著高于假手术组(P<0.01);斜坡实验测试角度结果显示脑源性神经营养因子预处理组显著高于转化生长因子组(P<0.01)高于睫状神经营养因子预处理组(P<0.01)显著高于假手术组(P<0.01);说明脑源性神经营养因子可以有效促进脊髓损伤后的康复效果;镀银染色变性神经元计数结果显示睫状神经营养因子预处理组显著低于转化生长因子预处理组(P<0.05)低于脑源性神经营养因子预处理组(P<0.05)显著低于假手术组(P<0.01);说明睫状神经营养因子对脊髓损伤后神经元的保护作用最为明显。