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猪链球菌病(Swine streptococcal diseases)是由多种致病性链球菌引起的一种细菌急性、热性传染病。其中最为重要的是猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2),呈全球分布,不仅对养猪业的生产造成了巨大的危害,同时可导致人类发生脑膜炎、关节炎、败血症和心内膜炎,严重可致人类急性死亡。1998年江苏与2005年四川资阳爆发的链球菌,引发人猪混合感染,引起全国高度关注。因此对该病防治有重大公共卫生学意义。对猪链球菌2型的研究,目前集中在对毒力因子、毒力岛、双组分系统的研究上,对其致病机理还未有准确表述。高温热激需求蛋白(High temperature requirement A, HtrA)作为热休克诱导的一种丝氨酸蛋白酶,具有丝氨酸蛋白酶与分子伴侣的双重功能。该基因已发现于动植物、细菌、真菌、酵母、支原体以及人类多种生物中；对生物体逃避环境的高温和氧化应激有重要作用；在一些生物中有关于HtrA对细菌毒力、细菌在细胞的定植产生影响的报道；在人类的HtrA同源基因HtrA2也有报道与细胞凋亡和周期有关。本研究旨在通过克隆SC-19基因组中HtrA基因序列,并构建重组蛋白和基因缺失株,研究其与猪链球菌2型在致病力上的相关性,研究的具体结果包括：1.猪链球菌2型HtrA基因的鉴定、蛋白表达、纯化及免疫学研究通过公布的P1/7菌株HtrA基因、蛋白序列比对,以猪链球菌2型SC-19为模板,依据05ZYH33基因组(CP000407)序列进行引物设计。成功克隆HtrA基因后构建pET-32a (+)-HtrA重组质粒,并将其转化到Rosetta (DE3)表达菌中,0.2mM/mL浓度的IPTG,16℃诱导15h,通过Ni-NTA Agarose过柱纯化,得到纯化蛋白,经过SDS-PAGE与Western Blotting共同验证纯化蛋白为目的蛋白。通过对HtrA重组蛋白进行小鼠免疫与攻毒试验,对免疫血清进行抗体和IgG亚类测定,确定其较好的免疫原性。小鼠三免后用2.5LD50,1.8×109CFU/mL SC-19进行攻毒,证实重组蛋白对小鼠具有保护力。通过设计的HtrA基因引物,对猪链球菌不同血清型的HtrA基因分布进行测定,证实在多数猪链球菌中都存在HtrA基因。重组蛋白对Hep2细胞的黏附实验与抗血清对RAW264.7细胞的调理吞噬实验证实,重组蛋白对细菌在细胞上的黏附有影响,抗血清具有调理巨噬细胞吞噬细菌的作用。运用真核表达载体,将真核表达质质粒转入Hep2细胞中,通过流式细胞仪检测,证实HtrA有促进细胞凋亡的作用。2.猪链球菌2型HtrA基因缺失株的构建及生物特性研究为进一步阐明HtrA基因与猪链球菌2型致病的相关性,本研究构建其基因缺失株和互补菌株,并对其生物学特性加以研究。试验中构建了pSET4s-△HtrA同源重组质粒和pSET2s-c△HtrA互补质粒,分别电转入SC-19和基因缺失株△HtrA中,筛选得到基因缺失株△HtrA和互补菌株c△HtrA。本研究通过溶血活性测定、应激试验、细胞黏附试验证实,基因缺失株△HtrA较野生型都有明显的变化；但是在细菌形态、毒力上基因缺失株△HtrA在与野生型变化不明显。