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目的:阐述生化汤(Shenghua decoction,SHD)的物质基础和配伍机理。
方法:按照中医组方原则,设计不同缺药配伍组方,采用药效学研究不同配伍组方与全方之间差异,采用中药指纹图谱技术建立不同配伍组方体内外化学成分谱,并将体内外化学成分谱与药效学建立联系(即谱效关系),阐述生化汤的物质基础及配伍机理。
第一节生化汤不同配伍组方之间药效学的比较
1.按照“君臣佐使”的中医组方原理,撤药分析法制备生化汤各配伍组方的水煎液(各配伍组方水煎液最后均浓缩定容至同一体积,折合含当归0.56g/ml)。
2.药效学实验分组及给药方式:SD大鼠随机分为正常组(NS)、模型组(MG)、不同配伍组方的给药组(S1～S5)。按20 ml/kg的给药容积灌胃给予各组大鼠相应的生化汤配伍组方水煎液,每天2次,连续5天。
3.末次给药40 min后尾静脉注射10％高分子右旋糖酐(High moleculardextran,HMD)制作急性血瘀(Acute blood stasis,ABS)模型,20 min后采血,一部分血液用肝素抗凝,检测血液流变学指标:血浆黏度、红细胞聚集指数、血沉方程K值及红细胞电泳指数;另一部分血液用消炎痛-EDTA.Na2抗凝,分离血浆,放射免疫法测TXB2和6-Keto-PGF1α。
4.末次给药30 min后腹腔注射缩宫素制成原发性痛经(Primarydysmenorrhea,PD)模型,观察30 min内扭体次数:然后取血,分离血浆,可见分光光度法测T-SOD活力及MDA含量;取子宫并称重,计算子宫系数;制备10％子宫组织匀浆,可见分光光度法检测T-NOS活力、NO和蛋白含量。
第二节:生化汤不同配伍组方之间体外化学成分谱的比较及谱效关系分析
1.甲醇沉淀法处理生化汤各配伍组方水煎液,制成供试品溶液。
2.采用C18色谱柱,甲醇-0.2％甲酸为流动相线性梯度洗脱,流速为1.0ml/min,柱温30℃,检测波长270 nm,建立生化汤各配伍组方体外化学成分谱。
3.从整体上考察各缺药组方与全方之间体外化学成分谱的差异,并结合药效学的差异,进行谱效关系分析。
第三节:生化汤不同配伍之间体内化学成分谱的比较及谱效关系分析
1.按20 ml/kg的给药容积灌胃给予大鼠相应生化汤配伍组方的水煎液,每天2次,连续5天,末次给药60min后取血制备含药血浆。
2.甲醇沉淀蛋白法处理各生化汤各配伍组含药血浆。
3.采用C18色谱柱,以甲醇-0.2％甲酸为流动相线性梯度洗脱,流速为1.0ml/min,柱温30℃,检测波长270 nm,建立生化汤不同配伍组方血浆化学成分谱。
4.从整体上考察各缺药配伍组方与全方之间血浆化学成分谱的差异,并结合药效学的差异,进行谱效关系分析。
结果:第一节:生化汤不同配伍组方之间药效学的比较
1.生化汤全方对HMD引起的急性血瘀证,及对缩宫素引起的原发性痛经证均起到良好的治疗作用,且优于其它缺药配伍组方。
2.缺炙甘草组方以及缺炮姜炙甘草组方对大鼠子宫系数、30 min内扭体次数、血浆中的MDA、T-SOD等指标的影响与生化汤全方相比均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。
3.缺桃仁炮姜炙甘草组方对大鼠子宫系数、30 min内扭体次数、MDA、T-SOD、血浆黏度、TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α等指标的影响与生化汤全方相比均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。
4.当归方对大鼠子宫系数、30 min内扭体次数、MDA、T-SOD、血浆黏度、TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α红细胞聚集指数、红细胞电泳指数、血沉方程K值、TNOS和NO等指标的影响与生化汤全方相比均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。
第二节:生化汤不同配伍组方之间体外化学成分谱的比较及谱效关系分析
1.随着药味的缺失,生化汤各配伍组方与全方的化学成分谱之间的相似度逐渐减小。
2.与生化汤全方相比,缺炙甘草组方体外化学成分谱缺失了17、18、25、26、29号峰;同时5、7、11、16、19、24、30号峰的峰面积有显著性变化(P＜0.05或P＜0.01)。
3.与生化汤全方相比,缺炮姜炙甘草组方体外化学成分谱缺失了15、17、18、25、26、29号峰:同时7、11、16、19、24、30号峰的峰面积有显著性变化(P＜0.05或P＜0.01)。
4.与生化汤全方相比,缺桃仁炮姜炙甘草组方体外化学成分谱缺失了15、17、18、25、26、29号峰;同时1、6、7、11、13、14、16、19、24、30号峰的峰面积有显著性变化(P＜0.05或P＜0.01)。
5.与生化汤全方相比,当归方的体外化学成分谱缺失了3、10、12、15、17、18、21、22、25、26、27、28、29号峰;同时1、4、6、7、8、9、11、13、14、16、19、20、23、24、30号峰的峰面积有显著性变化(P＜0.05或P＜0.01)。
第三节:生化汤不同配伍之间体内化学成分谱的比较及谱效关系分析
1.与体外化学成分谱比较,生化汤全方血浆化学成分谱中2、5、7、10、11、14、16、17、18、19、20号峰为直接吸收入血的原型成分;a、b、c、d、e、f、g、h、I、j、k、L号峰可能为原方中化学成分在血浆中的结合物或其代谢产物。
2.与生化汤全方相比,缺炙甘草组方血浆化学成分谱缺失了17、d、e、L号峰;同时7、20、g号峰的峰面积有显著性变化(P＜0.05或P＜0.01)。
3.与生化汤全方相比,缺炮姜炙甘草组方血浆化学成分谱缺失了17、d、e、L号峰;同时19、20、g号峰的峰面积有显著性变化(P＜0.05或P＜0.01)。
4.与生化汤全方相比,缺桃仁炮姜炙甘草组方血浆化学成分谱缺失了17、d、e、L号峰:同时5、16、18、19、20、g号峰的峰面积有显著性变化(P＜0.05或P＜0.01)。
5.与生化汤全方相比,当归方血浆化学成分谱缺失了11、17、d、e、f、h、L号峰;同时2、5、7、10、14、16、18、19、20、b、c、g、I、j、k号峰的峰面积有显著性变化(P＜0.05或P＜0.01)。
结论:生化汤全方的药效最好,其组方配伍是科学、合理的;全方中29个化学成分可能是生化汤物质基础的组成部分;生化汤给予大鼠后产生的22个血浆移行成分是生化汤物质基础的重要组成部分;生化汤配伍过程中由于物质基础发生了变化,从而产生了不同的药理效应和治疗作用。