研究背景糖尿病是在世界各地日益严重的健康问题和主要的慢性疾病。国际糖尿病联合会(International Diabetes Federation, IDF)估计,到2014年全球将有3.87亿人患有糖尿病,而到2035年这一数字将上升到5.92亿。糖尿病及其相关并发症将导致巨大的经济负担和死亡率,糖尿病并发症包括心脏疾病、中风、糖尿病足、糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病等。在2014年,糖尿病引起的医疗支出至少6120亿美元,占成人总医疗支出的11%。此外,在2014年糖尿病引起了490万例患者死亡,这意味着每七秒就有一糖尿病患者死亡。因此,寻找新的和有效的治疗糖尿病的方法是非常重要和紧迫的。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM),以胰腺胰岛细胞分泌胰岛素功能减退合并胰岛素敏感靶器官有害的胰岛素抵抗为特征,约占所有糖尿病的90%。目前,治疗T2DM的主要方法包括生活方式干预、药物和减重手术。越来越多的证据表明减重手术是目前治疗伴肥胖T2DM最有效的方法,它能迅速而持续地减轻体重,以及显著改善甚至完全缓解T2DM。随着糖尿病患病率逐年上升,过去10年中在全球进行减重手术的总数也不断增加。2013年,全世界最常见的减重术式依次是Roux-en-Y胃旁路术(Roux-en-Y gastric bypass,RYGB),约占所有减重手术的45%,其次为袖状胃切除术(sleeve gastrectomy,SG),约占总数的37%,以及可调节胃束带术:(adjustable gastric banding, AGB),约占总数的10%。RYGB术后食物流通过小胃囊排入中段空肠,胆胰液转流到远端空肠,被证明能长期有效地减轻体重并且缓解诸如血脂异常、高血压、脂肪肝、糖尿病肾病和视网膜病等糖尿病并存病,故其被认为是减重手术的标准术式。然而,介导RYGB后抗糖尿病作用的内在机制仍然知之甚少。RYGB抗糖尿病效应的一些潜在作用机制包括激素分泌、肠道菌群和胆汁酸循环的改变等。累积的证据表明,RYGB后由于肠道早期暴露于未充分消化的食糜,小肠出现形态学适应和葡萄糖代谢功能重构,这可能是减重手术治疗糖尿病的作用机制。近期,肠道糖异生参与调控葡萄糖稳态的一种新的功能被提出,这一功能被认为可能是减重手术治疗糖尿病的作用机制。尽管肝脏和肠道糖异生功能得到了确认和较多的研究,然而糖异生在RYGB治疗糖尿病中的作用还没有定论。本研究的目的是在T2DM大鼠模型中观察RYGB对葡萄糖稳态、脂质代谢、血清胆汁酸水平、肠道形态适应以及肝脏和肠道糖异生的影响。本次研究的结果可能为阐明RYGB缓解糖尿病的潜在代谢机制提供新的见解。材料与方法1、动物与饲养条件该动物研究获得了上海市第六人民医院动物实验伦理委员会审核通过。三十只6周龄雄性SD大鼠购自中英Sippr/BK实验动物有限公司(上海,中国)。所有动物保持在12小时光照/黑暗周期控制环境温度(24±2℃)和湿度的单个笼中。所有的大鼠自由进食自来水和饲料,除非另有说明。经过2周适应后,30只大鼠喂食高脂肪饲料(high-fat diet, HFD)(60%脂肪,20%碳水化合物,20%蛋白质,热量总百分比；Research Diets, Inc.,美国)4周以诱发胰岛素抵抗。高脂喂养后大鼠禁食12小时,腹腔注射1%链脲佐菌素(streptozotocin, STZ; 35 mg/kg) (Sigma公司,美国)以诱发糖尿病状态。STZ注射七十二小时后,采集尾静脉血液用血糖仪(Sinocare公司,中国)两次测定非空腹血糖。非空腹血糖≥16.7 mmol/L的大鼠被认为是T2DM大鼠,T2DM大鼠被随机分配到假手术组(Sham group, n = 10)和RYGB组(RYGB group, n = 10)。所有大鼠注射STZ后以普通饲料(10%脂肪,70%碳水化合物,20%蛋白质,热量总百分比;Research Diets, Inc.,美国)喂养。注射STZ一周后,对假手术组和RYGB组大鼠进行相应假手术或RYGB手术。在所有组中,体重和食物摄入量在手术后2周内每天测量1次,随后剩下时间每2周一次。用血糖仪测量各组大鼠空腹血糖,术后2周内每周1次,随后每2周一次。2、手术方法禁食24小时后,以1%戊巴比妥钠溶液腹腔内注射(5 ml/kg)对大鼠进行麻醉。RYGB术以长约4cm的正中切口开腹,在胃食管交界处下方5 mm从小弯侧到大弯侧将胃水平横断。近端胃以4-0丝线(宁波医用针线,中国)单纯间断缝合关闭创建一个小胃囊,远端残余胃以相同的方法缝合关闭。在Treiz韧带下方10厘米横断空肠,两侧断端以4-0丝线结扎。将远端空肠拉到小胃囊处,分别在肠对系膜缘和近胃大弯胃前臂处切开7mm小口,小胃囊与远端空肠以侧侧胃肠吻合的方式连接。携带胆胰液的近端空肠与Roux支在胃肠吻合口下方15cm处以侧侧空肠空肠吻合的方式重新连接。胃肠吻合和空肠空肠吻合均用5-0丝线(宁波医用针线,中国)以单纯间断内翻缝合方式进行,形成约7mm的吻合口。假手术组大鼠进行相同的开腹,在与RYGB手术相同位置进行胃肠横断,并在原来位置吻合,以产生与RYGB相同的手术和麻醉应激效果。手术大鼠在术后24小时开始给予葡萄糖氯化钠溶液喂养,在术后4天开始恢复普通饲料(10%脂肪,70%碳水化合物,20%蛋白质,热量总百分比；Research Diets, Inc.,美国)喂养。所有大鼠在术后8周禁食一晚后处死。空肠(在假手术组为屈氏韧带下约17厘米近端空肠,在RYGB组对应空肠滋养支中间段)、回肠(距离回盲部约10厘米处)和肝脏活组织一份在福尔马林中固定用于常规组织学检查,另一份经液氮冷却后储存在-80℃用于实时定量RT-PCR和蛋白免疫印迹。3、口服葡萄糖耐量试验在术前、术后2周和8周进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。大鼠禁食一晚后,以20%葡萄糖(1g/kg)灌胃。使用血糖仪测量空腹以及灌胃后30、60、90和120min血糖。4、胰岛素耐量试验在术前、术后2周和8周进行胰岛素耐量试验(ITT)。大鼠禁食一晚后,腹腔注射人胰岛素(0.5 IU/kg)。采尾静脉血测量清醒大鼠空腹以及注射胰岛素后30、60、90和120min血糖。5、血清脂质和总胆汁酸检测晚上禁食后,分别于术前及术后2周、8周采集清醒大鼠空腹尾静脉血样到含有EDTA溶液的冷却管。在4℃离心(1006×g)15分钟后,立即提取血清并存储在-80℃备用。血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFAs)和总胆汁酸根据使用说明用酶比色检测试剂盒测量。6、组织学分析每只大鼠的空肠和回肠组织标本用石蜡包埋后切片。将切片用苏木精和伊红(H&E)染色,通过光学显微镜观察。对于肠道形态适应的评价,由一位独立的病理专家在显微镜下观察(×100)所有组织切片后进行评估。7、实时定量RT-PCR总RNA根据制造商的使用说明用TRIzol (Invitrogen,美国)提取,并用分光光度计在260nm测定RNA浓度。实时定量逆转录聚合酶链反应(实时定量RT-PCR)在Roche LightCycler 480(罗氏诊断,德国)上进行。使用SYBR(?) Premix Ex Taq Master Mix (大连宝生物工程有限公司,中国)以1μg的cDNA进行分析,在10μl的总PCR反应体系中,含有每种引物0.2-0.6μM。溶解曲线分析判断PCR反应的特异性,每个样本重复3次取平均值进行分析。以β-actin表达量为内参照并以ΔΔCt方法比较mRNA的相对表达量。8、蛋白免疫印迹肝脏和肠道组织的总蛋白质用含有蛋白酶抑制剂(碧云天,中国)的RIPA裂解缓冲液提取,并通过BCA试剂盒(碧云天,中国)测定蛋白的浓度。将等量蛋白用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(碧云天,中国)进行电泳分离。然后将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上(密理博,美国)。使用针对下列蛋白质的抗体进行检测：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase) (Santa Cruz Biotechnology,美国)和β-actin (Cell Signaling Technology,美国)。在4℃下与一抗孵育过夜后,将膜放在辣根过氧化物酶结合二抗(Cell Signaling Technology,美国)中孵育60分钟。用ECL试剂(Thermo Scientific,美国)显影后在ImageQuant LAS-4000 mini (通用公司,美国)机器中检测蛋白条带并拍照。蛋白条带的强度用ImageJ软件评估。9、统计分析定量数据以均数(x)±标准差(s)表示。OGTT和ITT以曲线下面积(AUC)进行分析,AUCOGTT和AUCrTT用梯形积分法计算。重复测量数据(如体重、食物摄入量、空腹血糖、OGTT和ITT等),使用两因素重复测量方差分析(ANOVA)。特定时间点的组间比较,采用非配对t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。用SPSS 20.0进行统计分析。结果1、空腹血糖水平RYGB组和假手术组大鼠术前空腹血糖水平没有差别。假手术组大鼠术后空腹血糖逐渐升高,而RYGB组大鼠术后空腹血糖增长缓慢,并且于术后1周开始保持平稳。术后4周开始,RYGB组大鼠空腹血糖水平显著低于假手术组。2、体重和摄食量RYGB组和假手术组大鼠术前体重和摄食量没有差别。两组大鼠于术后1周体重下降到最低,假手术组大鼠体重于术后2周恢复到术前水平,而RYGB组大鼠从术后2周开始体重增长变缓。术后3周开始直至术后8周,RYGB组大鼠体重显著低于假手术组。术后2周开始直至术后8周,RYGB组大鼠摄食量显著低于假手术组。3、OGTT和ITTRYGB组和假手术组大鼠术前OGTT和ITT没有差别。术后2周和8周,RYGB组大鼠OGTT曲线下面积均显著低于假手术组,表明RYGB组大鼠葡萄糖耐量明显改善。术后2周和8周,RYGB组大鼠ITT曲线下面积均显著低于假手术组,表明RYGB组大鼠机体胰岛素敏感性明显改善。4、血脂水平RYGB组和假手术组大鼠术前空腹血清TC、TG和FFAs水平没有差别。术后8周,RYGB组大鼠空腹血清TG、FFAs水平较假手术组均显著下降。两组大鼠术后空腹血清TC水平较术前有轻度下降,但是术后两组大鼠空腹血清TC水平没有显著差异。5、空腹血清总胆汁酸水平RYGB组和假手术组大鼠术前空腹血清总胆汁酸水平没有差别。术后2周和8周,RYGB组大鼠空腹血清总胆汁酸水平明显高于假手术组6、小肠组织学变化RYGB组空肠与假手术组比较,肠绒毛的长度和数量显著增加。同样的,RYGB组回肠与假手术组比较,肠绒毛的长度和数量显著增加。7、肝脏及小肠糖异生关键酶表达水平RYGB组大鼠肝脏PEPCK和G6Pase mRNA表达水平均显著低于假手术组。此外,与基因水平相似,RYGB组大鼠肝脏PEPCK和G6Pase蛋白表达水平也均显著低于假手术组。RYGB组大鼠空肠PEPCK和G6Pase mRNA表达水平均显著高于假手术组。与基因水平相似,RYGB组大鼠空肠PEPCK和G6Pase蛋白表达水平也均显著高于假手术组。RYGB组大鼠回肠PEPCK和G6Pase mRNA表达水平均显著高于假手术组。与基因水平相似,RYGB组大鼠回肠PEPCK和G6Pase蛋白表达水平也均显著高于假手术组。结论1、RYGB能显著减轻T2DM大鼠模型的体重,并显著减少其摄食量。2、RYGB能显著改善T2DM大鼠模型的葡萄糖稳态及脂代谢功能。3、RYGB术后空腹血清总胆汁酸水平升高可能参与改善代谢。4、RYGB术后小肠表现出明显的增生和肥大等形态适应性改变。5、RYGB术后肝脏糖异生减弱,肠道糖异生增强,这可能参与改善机体葡萄糖稳态。RYGB术后小肠形态及功能的适应性变化在改善葡萄糖稳态方面的作用需要进一步研究确定。