甘蓝型油菜有限花序变异候选基因的筛选与克隆

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甘蓝型油菜(Brassica napus,AACC,2n=38)属十字花科芸薹属植物,是我国主要的油料作物。油菜花序通常为无限花序,是油菜重要的组织,其上着生角果,而角果内着生种子,最终决定油菜的产量。本文报道了一个新发现的有限花序自然突变体,该突变体末端着生一朵终止花,能够实现油菜开花和结角的提前终止,可为油菜的株型调控和选育适合机械化收获的油菜品种提供新思路。围绕新发现的有限花序突变体,本研究采用表型分析、遗传分析、转录组分析和基因克隆等多途径来研究其形成机制,主要研究结果如下:1.田间观测发现,突变型植株在株高、茎粗、一次及二次有效分枝数、一次有效分枝的高度、全株有效分枝数、全株角果数、角果长度、角果粒数、千粒重、花朵和花瓣的大小等农艺性状上高于野生型植株;而在主花序长度和主花序角果数性状上则略低于野生型植株。2.利用石蜡切片技术对野生型植株和突变型植株在2叶期、3叶期、4叶期、5叶期、6叶期及7叶期茎顶端分生组织进行观察,初步掌握了二者发育的微观表型差异发生过程,推断有限花序茎顶端变异发生在油菜发育的5叶期到6叶期之间。3.突变体材料GD605-2(Mutant-Type,MT)与4个(宁油7号、Bakow、97009和97081)常规甘蓝型油菜纯系材料(DH)进行正反交获得F1杂种,F1单株全部表现无限花序表型,说明该有限花序突变为隐性突变;而花序表型在F2出现分离,其中2018年无限花序单株数与有限花序单株数分离比为13:3(χ2=0.073,P=0.788);2020年突变型和野生型的正交后代中无限花序单株数与有限花序单株数分离比为13:3(χ2=0.519,P=0.471),反交后代中无限花序单株数与有限花序单株数分离比为13:3(χ2=2.169,P=0.141)。表明该突变表型由两对基因调控。4.采用转录组测序方法,对有限花序与无限花序花序调控基因的表达差异进行了检测,并利用荧光定量PCR对检测结果准确性进行了验证。通过GO和KEGG等功能分析,最终筛选到4100个表达上调的基因和2209个表达下调的基因;并结合有限花序调控网络、拟南芥和NCBI数据库等筛选出了TERMINAL FLOWER 1(TFL1)和APETALA 1(AP1)这两个主要的候选基因,并分别命名为Bn TFL1和Bn AP1。5.采用PCR扩增和测序等技术对Bn TFL1和Bn AP1这两个候选基因进行单克隆,应用NCBI的Blast在线工具并结合DNAMAN 6.0软件进行序列的对比,克隆得到一个油菜基因Bn TFL1,基因序列共1066个碱基,共编码178个氨基酸,野生型及突变型植株的Bn TFL1序列同源性为99.53%,氨基酸同源性为98.88%,并找到了第26位(P→R)和第175位(A→S)的氨基酸突变位点;同时还克隆了Bn AP1的CDS序列,基因序列共771个碱基,共编码256个氨基酸,野生型及突变型植株的Bn AP1序列同源性为98.96%,氨基酸同源性为99.22%,并找到了第122位(S→P)和第160位(A→S)的氨基酸突变位点。6.通过对Bn TFL1和Bn AP1在突变型单株和野生型单株的不同组织及不同时期的相关表达进行了荧光定量PCR分析。得到Bn TFL1主要在野生型和突变型单株的茎尖内表达,且在6叶期时的表达量最大。Bn AP1主要在野生型单株的叶片中表达,且在6叶期时的表达量最大;在突变型单株中,Bn AP1主要是在花(花蕾)中表达,且在2叶期时的表达量最高。该研究证实了GD605-2(MT)是一个新的甘蓝型油菜有限花序突变体。该突变体在油菜花序形态发育研究,油菜新株型材料选育,观光油菜特异材料选育,适宜机械化品种选育等方面具有参考价值。
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