3D 打印皮肤组织表皮层的种子细胞常用人角质形成细胞系和分离自皮肤组织的角质形成细胞。人角质形成细胞系为转化细胞,其性状和基因表达与正常的角质形成细胞有差异;分离自皮肤组织的角质形成细胞则扩增次数有限。表皮干细胞(Epidermal stem cells,EpSCs)能不断增殖,并分化成表皮层各种细胞,是3D打印组织工程理想的种子细胞,具有很好的应用前景。目前以EpSCs为种子细胞打印皮肤组织的报道很少。目的以人EpSCs和成纤维细胞为种子细胞,微挤压3D打印皮肤组织。方法1.用中性蛋白酶和胰蛋白酶消化人皮肤组织,快速贴壁法分离EpSCs。用免疫荧光染色和流式细胞术检测EpSCs标志分子(β1整合素、CK19、CD71和α6整合素)。用Ⅱ型胶原酶分离人真皮成纤维细胞,免疫荧光染色检测成纤维细胞标志分子(Vimentin)。2.通过MTT实验检测成纤维细胞在KGM2和DMEM培养基中的增殖情况,选择培养打印皮肤组织的培养基。3.以纤维蛋白原和明胶为支架材料,EpSCs和成纤维细胞为种子细胞,微挤压打印真皮层和表皮层,凝血酶交联。探索打印表皮层支架材料中纤维蛋白原和打印真皮层时成纤维细胞的合适浓度。4.通过活/死细胞实验检测打印皮肤组织中细胞的活性。5.通过苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色、免疫荧光染色观察打印皮肤组织的结构与细胞组成。6.通过甲苯胺蓝渗透试验检测打印皮肤组织的屏障功能。结果1.分离和培养的人皮肤EpSCs经免疫荧光染色显示CK19、或β1整合素阳性的细胞达90%以上;流式细胞仪检测显示高表达α6整合素、同时低表达CD71的细胞占90.73%。分离和培养的成纤维细胞经免疫荧光染色显示Vimentin阳性细胞占98%以上。证明分离和培养的EpSCs和成纤维细胞纯度较高。2.成纤维细胞在KGM2完全培养基中的增殖比在DMEM完全培养基中快,选择前者作为打印皮肤组织的培养基。3.当支架材料中的纤维蛋白原浓度在真皮层和表皮层分别为5mg/ml和10 mg/ml,成纤维细胞和EpSCs浓度分别为4×106/ml和5× 106/ml时,打印的皮肤组织在培养后细胞生长良好。HE染色和免疫荧光染色显示培养的打印组织表皮层和真皮层分层良好,表皮层厚度为74.72±5.25 μm,与正常皮肤组织表皮层厚度类似。4.甲苯胺蓝渗透试验显示气液培养7天的打印皮肤组织,其屏障功能和正常皮肤组织类似。结论以人EpSCs和成纤维细胞为种子细胞,纤维蛋白原和明胶为支架材料,微挤压打印含真皮、表皮层的皮肤组织,获得表皮层厚度及屏障功能和正常人皮肤组织类似的组织工程皮肤。