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血蓝蛋白（Hemocyanin,HMC）是近年来在对虾中新发现的一种多功能免疫因子，其不仅具有酚氧化酶、抗病毒、抑菌、凝集等多种免疫学活性，而且还可参与多条信号通路的调控。MAPK（Mitogen-activatedproteinkinase）信号通路是在高、低等生物中普遍存在的一条重要信号通路，其可介导细胞生长、分化和凋亡等多种生物学过程。有趣的是，本课题组前期采用RNA干扰（RNAi）和组学分析等方法，初步发现凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）血蓝蛋白有可能参与MAPK通路的调控。为此，本研究在此基础之上对其调控作用、作用机制和免疫学意义等进行了深入的探究，所获主要研究结果如下：
1.对虾血蓝蛋白对MAPK信号通路调控作用的研究
首先，在体内水平，采用RNAi和实时荧光定量PCR（Real-timePCR）方法，比较分析血蓝蛋白干扰前后肝胰腺中MAPK信号通路中关键基因在mRNA水平的表达变化情况。结果发现，与对照组相比，干扰对虾血蓝蛋白后MAPK信号通路中的关键基因ERK、p38、c-Jun和ATF2在mRNA水平表达明显上调。
继而，在体外水平，通过过表达实验和双荧光素酶报告实验（Dual-luciferasereportassay），比较分析在HEK293T细胞中过表达血蓝蛋白前后MAPK信号通路中SRE（Serumresponseelement）、AP1RE（AP1responseelement）和CRE（cAMPresponseelement）（其分别为ERK、JNK和p38信号通路报告基因）报告基因活性变化情况。结果显示，过表达血蓝蛋白可显著抑制SRE和CRE报告基因的活性，而对AP1报告基因的活性无显著抑制作用。
最后，在体外水平，采用过表达与Westernblot方法，比较分析在HEK293T细胞中过表达血蓝蛋白前后MAPK通路中关键蛋白的磷酸化水平变化情况。结果显示，与对照组相比，在过表达血蓝蛋白后，MAPK通路中关键蛋白MKK4、p38及ATF2的磷酸化水平显著下降，而ERK、JNK及c-Jun蛋白的磷酸化水平则无明显变化。
这些研究结果提示，对虾血蓝蛋白可能对p38MAPK信号通路具有负调控作用。
2.对虾血蓝蛋白调控MAPK信号通路分子机制的研究
首先，采用基因克隆和原核表达技术，体外原核表达血蓝蛋白GST-LvHMC与MAPK信号通路关键蛋白His-LvMKK4、His-LvERK、His-LvJNK或His-Lvp38，然后采用Pull-down技术分别探究血蓝蛋白与这些关键蛋白之间的相互作用关系。结果显示，与对照组GST相比，GST-LvHMC可分别与His-LvMKK4、His-LvERK或His-Lvp38三种关键蛋白发生明显的相互作用，而与His-LvJNK无相互作用。
继而，采用Co-IP等方法在果蝇S2细胞中分析LvHMC与LvMKK4、LvERK、LvJNK或Lvp38之间的相互作用。结果表明，与对照组相比，LvHMC与LvMKK4有明显相互作用，而与LvERK、Lvp38和LvJNK相互作用较微弱。
最后，在分段表达纯化血蓝蛋白N、M和C末端（GST-LvHMC-N、GST-LvHMC-M和GST-LvHMC-C）的基础上，采用Pull-down和Westernblot方法，探究LvHMC与LvMKK4的相互作用区域。结果发现，GST-LvHMC-M可与LvMKK4发生相互作用，而GST-LvHMC-N和GST-LvHMC-C不能与LvMKK4结合，提示与LvMKK4相互作用的区域为血蓝蛋白M端。
上述结果表明，血蓝蛋白M端可能通过与LvMKK4相互作用参与对p38MAPK信号通路的调控。
3.对虾血蓝蛋白调控MAPK信号通路免疫学意义的研究
首先，在体内水平，采用RNAi等方法干扰LvHMC或LvMKK4前后，比较分析肝胰腺细胞中ROS（Reactiveoxygenspecies）水平的变化情况。结果显示，与对照组相比，干扰LvHMC或LvMKK4后，肝胰腺细胞中ROS水平显著升高。
继而，在体外细胞水平，过表达LvHMC或LvMKK4前后，比较分析HEK293T细胞中ROS水平的变化情况。结果表明，与对照组相比，过表达LvHMC或LvMKK4后，HEK293T细胞中ROS水平显著降低。
由此提示，血蓝蛋白可能通过LvMKK4参与调控细胞中ROS的产生。
综上所述，本研究首次发现对虾血蓝蛋白M端可能通过与LvMKK4相互作用参与对p38MAPK信号通路的负调控，进而影响细胞内ROS的产生。所获结果对揭示血蓝蛋白在对虾免疫防御调控网络中的地位具有重要意义，同时为对虾病害的免疫学防治提供了重要的科学依据，促进对虾养殖业持续发展。
1.对虾血蓝蛋白对MAPK信号通路调控作用的研究
首先，在体内水平，采用RNAi和实时荧光定量PCR（Real-timePCR）方法，比较分析血蓝蛋白干扰前后肝胰腺中MAPK信号通路中关键基因在mRNA水平的表达变化情况。结果发现，与对照组相比，干扰对虾血蓝蛋白后MAPK信号通路中的关键基因ERK、p38、c-Jun和ATF2在mRNA水平表达明显上调。
继而，在体外水平，通过过表达实验和双荧光素酶报告实验（Dual-luciferasereportassay），比较分析在HEK293T细胞中过表达血蓝蛋白前后MAPK信号通路中SRE（Serumresponseelement）、AP1RE（AP1responseelement）和CRE（cAMPresponseelement）（其分别为ERK、JNK和p38信号通路报告基因）报告基因活性变化情况。结果显示，过表达血蓝蛋白可显著抑制SRE和CRE报告基因的活性，而对AP1报告基因的活性无显著抑制作用。
最后，在体外水平，采用过表达与Westernblot方法，比较分析在HEK293T细胞中过表达血蓝蛋白前后MAPK通路中关键蛋白的磷酸化水平变化情况。结果显示，与对照组相比，在过表达血蓝蛋白后，MAPK通路中关键蛋白MKK4、p38及ATF2的磷酸化水平显著下降，而ERK、JNK及c-Jun蛋白的磷酸化水平则无明显变化。
这些研究结果提示，对虾血蓝蛋白可能对p38MAPK信号通路具有负调控作用。
2.对虾血蓝蛋白调控MAPK信号通路分子机制的研究
首先，采用基因克隆和原核表达技术，体外原核表达血蓝蛋白GST-LvHMC与MAPK信号通路关键蛋白His-LvMKK4、His-LvERK、His-LvJNK或His-Lvp38，然后采用Pull-down技术分别探究血蓝蛋白与这些关键蛋白之间的相互作用关系。结果显示，与对照组GST相比，GST-LvHMC可分别与His-LvMKK4、His-LvERK或His-Lvp38三种关键蛋白发生明显的相互作用，而与His-LvJNK无相互作用。
继而，采用Co-IP等方法在果蝇S2细胞中分析LvHMC与LvMKK4、LvERK、LvJNK或Lvp38之间的相互作用。结果表明，与对照组相比，LvHMC与LvMKK4有明显相互作用，而与LvERK、Lvp38和LvJNK相互作用较微弱。
最后，在分段表达纯化血蓝蛋白N、M和C末端（GST-LvHMC-N、GST-LvHMC-M和GST-LvHMC-C）的基础上，采用Pull-down和Westernblot方法，探究LvHMC与LvMKK4的相互作用区域。结果发现，GST-LvHMC-M可与LvMKK4发生相互作用，而GST-LvHMC-N和GST-LvHMC-C不能与LvMKK4结合，提示与LvMKK4相互作用的区域为血蓝蛋白M端。
上述结果表明，血蓝蛋白M端可能通过与LvMKK4相互作用参与对p38MAPK信号通路的调控。
3.对虾血蓝蛋白调控MAPK信号通路免疫学意义的研究
首先，在体内水平，采用RNAi等方法干扰LvHMC或LvMKK4前后，比较分析肝胰腺细胞中ROS（Reactiveoxygenspecies）水平的变化情况。结果显示，与对照组相比，干扰LvHMC或LvMKK4后，肝胰腺细胞中ROS水平显著升高。
继而，在体外细胞水平，过表达LvHMC或LvMKK4前后，比较分析HEK293T细胞中ROS水平的变化情况。结果表明，与对照组相比，过表达LvHMC或LvMKK4后，HEK293T细胞中ROS水平显著降低。
由此提示，血蓝蛋白可能通过LvMKK4参与调控细胞中ROS的产生。
综上所述，本研究首次发现对虾血蓝蛋白M端可能通过与LvMKK4相互作用参与对p38MAPK信号通路的负调控，进而影响细胞内ROS的产生。所获结果对揭示血蓝蛋白在对虾免疫防御调控网络中的地位具有重要意义，同时为对虾病害的免疫学防治提供了重要的科学依据，促进对虾养殖业持续发展。