论文部分内容阅读
肿瘤干细胞(cancer stem cell)是肿瘤中一小群有干细胞特性的癌细胞,具有自我更新和多细胞分化等能力,是肿瘤发生、增殖、迁移和抗放化疗的重要原因。发现特异性的肿瘤细胞干细胞表面标志物,分离鉴定肿瘤于细胞,是研究肿瘤发生机制及其治疗方法的关键。CD133和CD117是重要的肿瘤干细胞表面标志分子,参与细胞生长、发育和肿瘤发生转移等过程,但是其互作蛋白及生物学功能仍需要进一步深入的研究。本论文以果蝇S2细胞为材料,通过RNAi技术阻断CD133同源基因prominin-like的表达,发现线粒体外膜蛋白(VDAC)和复合体Ⅰ亚基(NDUFS3)、复合体Ⅳ亚基(COXⅣ)等蛋白表达在prominin-like缺失的前2天显著降低,第3天后基本恢复到正常水平；复合体Ⅴ(ATP5a)蛋白表达几乎不受影响。与之相应的,prominin-like缺失细胞的ATP产量在1天和2天后显著降低,3天后回到正常细胞水平；ROS产量在1天和2天后显著升高,3天后回到正常细胞水平。表明prominin-like缺失会导致线粒体快速损伤,引起线粒体功能障碍。进一步通过FLP-FRT重组方法和CRISPR/Cas9基因敲除法构建了prominin-like突变体果蝇,电镜分析显示prominin-like突变体果蝇的线粒体出现嵴结构紊乱、密度变低及断裂等损伤,突变体果蝇运动能力变弱。接下来利用酵母双杂交技术筛选出prominin-like的新的互作蛋白ND20,其互作结构域位于prominin-like的55-164aa区段,通过GST pull-down和免疫共沉淀(Co-IP)方法确认了prominin-like与ND20之间的互作关系。敲低S2细胞prominin-like的表达,ND20立刻显著降低,3天后基本恢复正常；敲低ND20, prominin-like表达逐步下降,约3天后达到较显著差异。提示prominin-like处于互作关系的上游。进而对ND20的生物学功能进行深入研究,发现RNAi敲低果蝇S2细胞中ND20的表达,导致细胞G1期停滞,ROS水平升高,但ATP产量没有显著变化；线粒体蛋白(VDAC、NDUFS3和COX IV)表达逐步下降,ATP5a蛋白表达没有显著性变化。提示ND20缺失导致细胞功能和线粒体电子传递障碍,且prominin-like缺失可能是通过ND20对线粒体产生损伤,从而参与细胞能量代谢的调节。同时,本论文筛选鉴定出CD117同源蛋白PVR (PDGF/VEGF receptor related)的互作蛋白Shc及PVR的互作结构域(814-1510aa),并通过免疫共沉淀体内验证二者之间的互作关系,为PVR的进一步研究提供新的思路。