研究背景脑出血(cerebral hemorrhage,ICH)是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血,占全部脑卒中的15%~30%,其致死致残率较高。ICH发生后,除血肿压迫引起的机械性创伤即原发性损伤外,神经炎症、脑水肿和红细胞裂解产物等引起的继发性损伤在脑出血后的病理生理机制中发挥重要的作用。神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是指“涉及周围神经或中枢神经的躯体感觉神经系统的疾病或损伤引起的疼痛疾病”。卒中后中枢痛(central poststroke pain,CPSP)被广泛地认为是一种严重的慢性神经病理性疼痛,多在出血或缺血性脑卒中后6个月内出现,与病灶有关,发生在瘫痪躯体的一部分,呈持续或间断性且同时伴有感觉异常。任何影响到脊髓丘脑通路或前扣带回/皮层投射纤维的损伤或疾病均会引起疼痛,其中丘脑或丘脑腹后外侧核(VPL)在CPSP中发挥重要作用,它是疼痛传导通路的第3级神经元胞体所在。CPSP疼痛通常呈弥漫性,难以定位,性质多样,且患者之间差异较大,烧灼样、刀割样、针刺样、压榨样等均较常见且与其他疼痛难以区分。由于临床医师对CPSP认识较少,患者长期处于疼痛状态导致其出现抑郁、焦虑等情绪变化,这将加剧患者的疼痛,从而形成了恶性循环。但CPSP具体的发病机制尚不清楚,因此有必要建立稳定的动物模型,探讨其发病机理,为临床治疗提供有效的药物靶点。目前,关于CPSP的疼痛机制有中枢敏化,去抑制,中枢失衡等假说被提出,而神经炎症所诱发的中枢敏化在疼痛中的作用也愈加重要,小胶质细胞是中枢神经系统的免疫效应细胞,小胶质细胞及其介导的神经炎症在中枢神经系统疾病的转归过程中起着非常重要的作用。Martinez等研究发现小胶质细胞/巨噬细胞存在M1/M2极化类型,M1极化的小胶质细胞产生炎性细胞因子,主要是肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-а)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、促氧化酶(如诱导型一氧化氮合酶)和谷氨酸等有害细胞因子。据报道,小胶质细胞抑制剂米诺环素可以减轻脑水肿,降低脑萎缩,减少外源性TNF-α和IL-1β的表达从而缓解神经功能缺损。相反,M2极化的小胶质细胞具有精氨酸酶活性,产生神经营养因子和白细胞介素-10(interleukin 10,IL-10),M2小胶质细胞表型与脑损伤后的神经保护和再生作用有关。Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)是一种模式识别受体,目前已被证明与炎症性及免疫性疾病密切相关,激活后可以通过调控NF-κB信号通路途径生成并释放大量的促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子а(TNF-а)、白细胞介素6(IL-6)及一氧化氮(NO)等。在中枢神经系统中,TLR4主要表达在小胶质细胞表面,在小胶质细胞激活过程中发挥重要作用,并参与中枢神经系统免疫炎症过程,近期研究表明,TLR4与炎性痛以及神经病理性疼痛密切相关;同时在脑出血后,抑制TLR4的表达可以减少脑损伤体积,降低脑水肿,保护损伤的神经元、改善神经功能。但其是否参与CPSP的病理过程尚不明确。因此,本研究提出假设:若脑出血发生在丘脑腹后外侧核(VPL),小胶质细胞过度激活,M1型小胶质细胞表型增加,TLR4/MyD88信号通路激活,产生炎症因子TNF-а、IL-6、IL-1β等,参与卒中后中枢痛的产生与维持(图1)。图1本研究假设图研究目的使用VII型胶原酶建立稳定的大鼠丘脑出血CPSP模型;检测该模型的行为学变化;分析脑出血周围小胶质细胞激活情况及小胶质细胞表面炎症相关蛋白分子表达变化、大鼠血清中促炎细胞因子TNF-α,IL-6水平以及小胶质细胞表型特点。本研究旨在探索神经炎症在CPSP发生过程中的作用,在分子水平研究其发生发展机制,为临床CPSP患者疼痛的治疗提供理论依据。研究方法(1)设立不同剂量组,探索VII-s型胶原酶使用剂量将动物分为四组:sham组和CPSP(0.1U,0.2U,0.3U)组。CPSP组大鼠采用VII-s型胶原酶(0.1U,0.2U,0.3U)立体定位注射入大鼠右侧丘脑腹后外侧核(VPL),立体定位坐标为前囟后3.5mm,右侧旁开3.3mm,距颅骨表面深度为6.0mm,即SD大鼠脑部图谱中VPL最明显的平面的定位。sham组大鼠注射等剂量的生理盐水,其他操作与CPSP组一致。在术前及术后7d,14d,21d,28d分别检测SD大鼠50%机械刺激缩足反射阈值(MWT)和热刺激缩足反射潜伏期(TWL),确定VII-s型胶原酶使用的最佳剂量,以期建立稳定的大鼠CPSP模型。(2)制作CPSP动物模型,检测术后行为学变化将动物分为两组:sham组和CPSP组。术后观察大鼠运动功能改变,包括Longa评分,前肢放置实验,后肢放置实验,转角实验;痛行为学检测:包括机械痛阈,热痛阈及冷痛阈;情绪样行为学检测:包括焦虑相关行为学测量(旷场实验)及抑郁相关行为学测量(强迫游泳实验,蔗糖偏好实验)。(3)分析丘脑出血后胶质细胞激活情况及损伤周围组织TLR4/MyD88信号通路相关蛋白表达的变化应用免疫组化及蛋白印迹实验定性及定量分析脑出血周围组织小胶质细胞及星形胶质细胞激活情况;验证小胶质细胞与TLR4的共标情况;小胶质细胞表面炎症相关蛋白分子TLR4,及其下游的MyD88,NF-κB表达变化。应用酶联免疫吸附法测定术后大鼠血清中促炎细胞因子TNF-α,IL-6水平。采用流式细胞术分析小胶质细胞表型特点以验证假设。(4)腹腔注射TLR4抑制剂TAK242,探讨应用抑制剂后行为学及相关分子表达变化。将实验动物分为三组:sham组,CPSP+vehicle组及CPSP+TAK242组。CPSP+TAK242组于丘脑出血后6h首次腹腔注射TAK242(3 mg/kg),连续5天。CPSP+vehicle组注射等剂量生理盐水,其他操作一致。分别检测术前和术后7d、14d、21d和28d的机械痛阈、热痛阈及冷痛阈。同时检测该条件下小胶质细胞激活情况及损伤周围组织TLR4/MyD88信号通路相关蛋白表达的变化。研究结果(1)制作大鼠丘脑出血模型的最佳VII-s型胶原酶剂量为0.2U:与sham组相比,CPSP(0.1U,0.2U,0.3U)组大鼠损伤对侧后肢机械痛阈均明显降低,持续至28天(***P<0.001);但是0.1U剂量组大鼠损伤对侧后肢热痛阈在14d,21d明显下降,0.2U及0.3U剂量组大鼠损伤对侧后肢热痛阈在7d,14d,21d均有差异。另外,在建模过程中,0.3U剂量组术后24h内大鼠出血体积较大且存在死亡率,0.1U及0.2U剂量组未出现该情况。综上,本研究选择0.2UVII-s型胶原酶作为本实验制作CPSP动物模型的最佳剂量。(2)丘脑出血后大鼠运动功能未见损伤,痛阈降低,伴随情绪的变化:与sham组相比,CPSP组大鼠术后Longa评分均为0分,即无神经功能缺损情况出现,CPSP组大鼠各时间点前肢放置实验、后肢放置实验以及转角实验评分均无明显差异(P>0.05),表明CPSP组大鼠运动功能未受损,在此基础上,本研究所检测的痛阈变化更具参考意义。与sham组相比,CPSP组大鼠对侧后肢机械痛阈显著降低(***P<0.001),机械痛阈测试至28d,差异仍较明显,且机械痛可持续术后42d;热痛阈于术后7d出现明显差异(**P<0.01),在检测期间疼痛持续至14d;冷痛阈于术后7d出现显著性差异(**P<0.01),测试持续至28d,差异仍较明显。机械痛阈及冷痛阈在第21d基本到达最低水平,并逐渐达到稳定状态。与sham组相比,CPSP组大鼠术后出现焦虑抑郁倾向,在旷场实验测试中,CPSP组大鼠在中央区域的运动时间显著下降;而在强迫游泳实验中,CPSP组大鼠在游泳杯中“不动状态”的时间增加;在蔗糖偏好实验中,CPSP组大鼠蔗糖摄入的百分比下降,提示快感缺乏。(3)丘脑出血后损伤周围组织胶质细胞激活,神经炎症相关指标上调:与sham组相比,CPSP组大鼠脑血肿周围组织小胶质细胞和星形胶质细胞表达量明显增加,呈激活态。TLR4与小胶质细胞完全共标,但与星形胶质细胞不共标。CPSP组大鼠脑损伤周围组织TLR4、MyD88、p-p65表达量均上调,提示小胶质细胞TLR4/MyD88信号通路激活,其下游血清中的促炎细胞因子肿瘤坏死因子а(tumor necrosis factor-α,TNF-а)和白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)表达量增加。(4)应用TLR4抑制剂TAK242后,痛阈升高,神经炎症相关指标下调:与sham组大鼠相比,CPSP+vehicle组大鼠右侧(即术侧)大脑半球脑水含量增加,应用TAK242后脑水含量下降(78.06±2.626 in TAK242-treated组vs81.34±1.903 in vehicle-treated组)。腹腔注射TAK242后,与CPSP+vehicle组相比,机械痛阈于术后7d、14d、21d、28d均升高,同时冷痛阈也具有明显变化,热痛阈在术后7d及14d升高。另外Western-blot结果显示下游MyD88、p-p65的表达量下调,ELISA结果显示炎症因子TNF-α、IL-6表达均有明显的下调。因此TAK242可能是通过降低TLR4/MyD88信号通路蛋白表达量及其下游的炎症因子缓解CPSP疼痛。研究结论(1)本研究应用Ⅶ-s型胶原酶成功建立大鼠丘脑出血模型,行为学结果显示丘脑VPL出血可诱发卒中后中枢痛,大鼠出现抑郁及焦虑样等行为学变化。(2)丘脑VPL出血后小胶质细胞激活,TLR4/MyD88信号通路介导的神经炎症可能参与卒中后中枢痛的发生和发展。