论文部分内容阅读
本研究建立并验证了Caco-2细胞模型和原代肝细胞模型,并在此基础上建立了ADME/Tox并联测试体系,通过并联测试体系研究小柴胡汤体外吸收成分的代谢和毒性,探讨其药效-毒性机制。1. Caco-2细胞模型的建立和验证：本实验室前期已建立并验证了Caco-2细胞模型。Caco-2细胞接种于Millicell插入式培养皿中按标准培养21天,通过倒置显微镜观察Caco-2细胞形态,并通过测定Caco-2跨膜电阻(TEER)评价Caco-2细胞模型的完整性和紧密性。结果显示Caco-2细胞单层连接紧密,TEER值大于550Ω·cm2,建立的Caco-2细胞模型完整性和紧密性良好,与实验室前期所建立的Caco-2细胞单层模型结果相同,可以作为研究药物小肠转运过程的体外模型。2.原代肝细胞模型的建立和验证：根据改良的Seglen两步胶原酶灌注法,分离并培养大鼠原代肝细胞,用台盼蓝染色后,其存活率在70%-93%之间；在倒置显微镜下可观察到原代肝细胞在1小时后开始贴壁生长,并在24小时后开始发生形态变化；同时,检测原代肝细胞培养上清液中白蛋白和尿素氮的含量,判断原代肝细胞的分泌功能。结果显示,肝细胞分泌白蛋白的功能在第3天达到高峰,尿素氮的分泌在培养第3、4天达到最佳状态。因此,以第3天作为给药时间。3. Caco-2细胞／肝细胞联合模型及小柴胡汤ADME/Tox研究：将培养21天的Caco-2细胞模型与培养3天的大鼠原代肝细胞模型结合起来,建立ADME/Tox并联测试体系,同时考察小柴胡汤在体外的吸收和代谢过程。在AP侧加入小柴胡汤提取物,收集BL侧代谢样品,用HPLC法检测经过联合模型和分步模型吸收和代谢后的小柴胡汤提取物的成分变化,空白组为通过Caco-2细胞模型吸收的小柴胡汤提取物。本文建立了小柴胡汤代谢样品中三个有效成分的高效液相(HPLC)测定方法。色谱条件为：色谱柱Symmetry ShieldTM RP18 (5.0μm, 4.6mm×250mm Column);流动相为乙腈-0.01%磷酸溶液梯度洗脱；流速为0.45ml/min;检测波长为270nm；柱温为30℃。结果显示本方法的准确度、精密度、重现性、专属性和定量线性范围均符合要求,该方法简便快速、准确可靠,能同时测定小柴胡汤代谢物中黄芩苷(BCN)、汉黄芩苷(WGS)、汉黄芩素(WGN)的含量。结果显示,经过联合模型和分步模型吸收并代谢的小柴胡汤提取物中,联合模型组中三个成分含量分别为2.60±0.11μg,2.03±0.11μg,0.65±0.05μg；分步模型组中三个成分含量分别为2.37±0.37μg,2.72±0.53μg,0.44±0.09μg,两个组中的黄芩苷和汉黄芩苷含量均高于空白对照组(p<0.01)而汉黄芩素低于空白对照组,混合标准品组中未检测到汉黄芩素(低于检测下限),黄芩苷含量为2.62±0.30μg；分步模型组汉黄芩苷含量高于联合模型组,p=0.011(p<0.05),汉黄芩素含量低于联合模型组,p=0.001(p<0.01)。4.小柴胡汤肝脏的毒性机制研究：小柴胡汤提取物作用于联合模型和分步模型后,收集BL侧样品,检测其中AST, LDH的含量,结果显示联合模型组AST、LDH含量均高于空白对照组(p<0.01)；分步模型组AST与空白对照组差异无统计学意义(p=0.183),LDH低于空白对照组p=0.000(p<0.01)。混合标准品组LDH高于空白对照组(p<0.01),AST与空白对照组无统计学意义(p>0.05)。由此我们认为,小柴胡汤对联合模型组和混合标准品组的肝细胞均有损伤,对分步模型组肝细胞有保护作用。