大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)是原产于欧洲沿海的一种名贵的比目鱼。自我国1992年从英国引进以来,因其生长速度快、肉质鲜美、易驯化以及抗逆性强等特点,迅速成为北方海水养殖的主要经济鱼类。然而,近几年,随着工厂化养殖水平的不断提高,大菱鲆养殖产业出现一些问题。由于大菱鲆育种工作主要依赖国外引进亲本,亲本资源有限,加上累代养殖以及近亲交配,使得大菱鲆种质资源退化严重,严重制约了大菱鲆养殖业的可持续发展。因此对大菱鲆进行遗传改良,选育具有优良生长性状的大菱鲆新品种是发展大菱鲆养殖业的当务之急。随着生物技术的不断创新与进步,分子标记技术被运用到育种工作中来,利用传统育种加上分子标记辅助育种的模式已经成为鱼类育种的有效手段。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是微卫星标记之后的第三代的分子标记技术。SNP标记在基因组中密度高,遗传稳定性好并且易于自动化分析,因此被广泛地应用于动植物的遗传育种中。本研究以实验室前期利用数量性状位点(QTL)定位作图筛选获得的100个与大菱鲆生长性状相关的候选单核苷酸多态(SNP)位点为基础,利用飞行质谱法(TOFMS),在四个大菱鲆家系群体中进行基因分型,并与体重和体长两个生长性状数据进行关联分析,以期在多家系群体中进一步验证与大菱鲆生长性状紧密关联的SNP位点。其次,利用100个SNP位点对大菱鲆四个家系进行遗传多样性检测,并对四个家系群体的遗传分化及亲缘关系进行分析。最后利用反转录PCR技术(RT-PCR)对大菱鲆生长性状相关的SNP位点SNP86所在基因——NOTCH1基因部分序列进行了基因克隆,并利用实时荧光定量PCR的方法对NOTCH1基因在大菱鲆2月龄和5月龄幼鱼的各个组织的表达情况进行了初步的研究。实验分为以下三个部分:1、大菱鲆生长性状与SNP位点的关联分析利用飞行质谱法,对100个通过连锁图谱-QTL定位筛选获得的与大菱鲆生长性状相关的SNP位点在四个大菱鲆家系群体中进行基因分型,利用一般线性模型对基因型和体重、体长两个生长性状数据进行关联分析。关联分析结果表明,有9个snp位点与生长性状关联显著(p<0.05)。9个位点中,4个位点与体重显著关联(p<0.05),7个位点与体长显著关联(p<0.05)。其中,snp51和snp111与体重和体长两个性状均关联显著(p<0.05)。分析关联显著的snp位点多态性发现,观测杂合度(ho)在0.126-0.719之间(平均为0.387),期望杂合度(he)在0.118-0.501之间(平均为0.338);9个位点的平均多态信息含量(pic)为0.267,属于中度多态性位点;哈迪温伯格平衡(hwd)检验结果表明9个位点中有5个位点偏离平衡。通对18号连锁群(lg18)的5个位点进行连锁不平衡和单倍型分析发现,标记间存在显著的连锁不平衡;单倍型cttgt和cttga是两个主要的单倍型,单倍型频率分别为26.8%和25.9%。最后,根据关联显著snp位点所在的序列信息,在ncbi数据库比对分析后发现col11a1基因和notch1基因可能是与大菱鲆生长性状相关的重要功能基因。该研究结果将推进大菱鲆生长相关分子标记的研究,为下一步基因定位以及分子标记辅助育种提供更多的标记基础。2、基于snp标记的四个大菱鲆家系的遗传多样性分析利用100个snp位点对四个大菱鲆家系进行遗传多样性分析。结果表明,88个成功分型的位点中,11点位点在大菱鲆家系群体中没有多态性,多态位点的比例为87.5%。4个家系的平均等位基因数在在1.6477到1.7614之间,其中3号家系的有效等位基因数最多,为1.4796。杂合度方面,四个家系的平均观测杂合度均大于期望杂合度,群体中表现出一定的杂合度过剩,也说明四个家系的遗传多样性水平很高。多态信息含量分析结果显示,四个家系的平均pic都小于0.25,属于低度多态性。综合比较,3号家系的多样性水平最高。利用popgene软件对家系间遗传分化进行分析,结果17.52%的遗传分化来自家系间,82.48%的遗传分化来自家系内。根据四个家系的遗传距离进行聚类分析得出家系间遗传关系比较近,其中2号家系和4号家系首先聚为一类,然后再与3号家系聚为一类。综上所述,大菱鲆家系群体的遗传多样性处于很高的水平,遗传分化明显,无显著近交现象的发生,这与大菱鲆良种培育技术路线中控制近交的思路是一致的。3、大菱鲆生长性状相关基因克隆及表达分析利用rt-pcr方法对与大菱鲆生长性状显著关联的snp86位点所在的基因——notch1基因进行了部分序列的基因克隆,成功克隆出一段长544bp的包含snp86位点突变碱基的cdna序列。通过blastx程序对克隆片段进行同源性比对发现,与其他鱼类如斑马鱼、半滑舌鳎以及虹鳟鱼等的notch基因的同源性达到95%以上。另外,利用实时荧光定量pcr技术对notch1基因在大菱鲆2月龄和5月龄幼鱼的组织表达情况进行分析,分析结果显示,NOTCH1基因在两个时期幼鱼的心脏组织中表达量最高,其次是眼睛,在肝脏、脾脏等组织中微弱表达。对两个时期各组织的表达情况进行差异显著分析可知,NOTCH1基因在2月龄和5月龄两个时期幼鱼的各组织中的表达水平存在显著性差异。根据NOTCH基因在其他鱼类的研究结果,下一步可以针对NOTCH基因在大菱鲆胚胎发育初期的表达水平进行研究,进一步探究该基因与生长发育之间的关系。研究结果将有利于大菱鲆生长性状相关基因定位与筛选,进一步推进大菱鲆分子辅助育种进程。