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蜱是吸血性节肢动物,传播多种人类疾病的病原体。蜱虫的唾液中含有大量生物活性的分子,抑制不同的宿主防御机制,从而帮助蜱来麻痹宿主,从而更有效的吸血,还能够帮助它所传播的病原体逃避宿主局部的免疫反应,提高了这些病原体的早期存活机率。Cathepsin蛋白家族是各种动物组织的细胞内(特别是溶酶体中)发现的一类蛋白酶,在天然免疫和适应性免疫中发挥重要作用,包括抗原降解、加工和递呈,细胞的凋亡,TLR的激活,细胞因子分泌和丝氨酸蛋白酶的激活。Cystatin是Cathepsin的天然抑制物,在哺乳动物和其他动物中广泛表达,进化过程中序列和结构相对比较保守。在这项研究中,我们从采自中国东北的森林革蜱中克隆了一个新的蜱分泌蛋白—DsCystatin,它是Cystatin蛋白家族成员。DsCystatin基因编码128个氨基酸,其中包含一个21个氨基酸的信号肽。实验表明:重组表达的DsCystatin蛋白能抑制人组织蛋白酶L和B的酶活性,且有剂量依赖效应。GST pull down的方法证明,DsCystatin可以直接与人的组织蛋白酶L和B相互作用。Ds Cystatin抑制骨髓来源的树突状细胞对抗原的降解。DsCystatin可以抑制由LPS或伯氏疏螺旋体刺激的小鼠骨髓来源的巨噬细胞的炎性细胞因子IL1β,IFNγ,TNFα和IL6等的mRNA和蛋白水平表达。Ds Cystatin能够下调骨髓来源的巨噬细胞和树突状细胞表面的CD80和CD86分子的表达,抑制其活化。DsCystatin被发现抑制炎性细胞因子mRNA水平的表达,而NFκB的激活是是促炎症细胞因子mRNA表达调控的关键转录因子,我们进一步的实验证明,DsCystatin可以抑制LPS或伯氏疏螺旋体对NFκB的激活。在稳定表达TLR4的293T-TLR4细胞中,我们用转录因子报告基因实验探究DsCystatin在TLR4通路上的作用。我们发现,DsCystatin抑制TRAF6这个阶段对下游NFκB的激活。在骨髓来源的巨噬细胞内DsCystatin抑制LPS的诱导p50表达以及p50蛋白的入核;在Raw264.7细胞中,DsCystatin抑制IKBα的表达及磷酸化;在Raw264.7和293T-TLR4细胞中,Ds Cystatin抑制LPS的诱导TRAF6和TAK1的表达。最后,我们研究了Ds Cystatin在小鼠炎症模型中的作用。在弗氏完全佐剂诱导的小鼠炎症疾病模型中,DsCystatin可以减轻炎症的发生,并可以缓解小鼠关节的肿胀。在伯氏疏螺旋体诱导的小鼠关节炎症疾病模型中,DsCystatin抑制了小鼠体内抗螺旋体抗体的产生,并抑制了关节的肿胀。这些数据表明来自森林革蜱的分泌型唾液蛋白Ds Cystatin是一种新的免疫抑制蛋白,能够抑制天然免疫细胞的活化,并且在治疗或缓解炎症性疾病中存在潜在价值。