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由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是高度传染的全球性鸡病之一,严重危害养鸡业。IBV众多的血清型及其基因组的不断变异给IB的免疫防控带来很大的困难。由IBV变异引起的疫苗免疫失败现象越来越多。IBV N基因及其编码蛋白在病毒RNA的复制、包装、核衣壳的形成、诱导体液免疫和细胞免疫应答等方面有重要意义。本研究对8株IBV陕西分离株的N基因的遗传变异进行了研究,目的是从分子水平上探索我国IB疫苗免疫失败的原因,并对N基因及其编码蛋白在IBV抗体水平监测、诊断和IBV基因工程疫苗等方面的应用进行了初探。研究内容如下:1.用RT-PCR方法对8个IBV陕西分离株(WH、YX、YL、BJ、WG、G5、FF2、B01)的N基因进行了扩增,各扩增产物经克隆、测序后与GenBank登录的7个IBV参考毒株的N基因进行核苷酸序列、氨基酸序列和系统进化树比较分析。结果表明,IBV陕西分离株与参考毒株的同源性差异较大(85.5%～87.3%),所有分离株N蛋白突变均以散在的点突变形式为主,其变异与组织嗜性无明显相关性;分离株WH、YX和YL与参考毒株Ark99及Gray在同一进化分支上,差异较小;而BJ、WG和G株则形成一个独立的进化分支,与我国疫苗毒株W93、H120及其他参考毒株差异较大;B01株与M41株在进化上接近,与Beaudette株、EP3株在同一进化分支;FF毒株与其他毒株N蛋白差异最大,排在进化树最始端。实验结果提示,我国IBV地方分离株N基因变异有不断加大的趋势。2. IBV陕西分离株G5(W118)已作为我国动物疫苗生产企业--杨凌绿方生物工程有限公司IBV多价灭活苗的制苗毒株之一,该灭活苗对于预防肾变型IB有明显效果。为了从分子水平上揭示W118株的遗传背景和免疫效果,用RT-PCR方法扩增了W118株S1、M和N基因,经克隆和测序后与GenBank登录的IBV参考毒株进行序列比较分析。结果表明,IBV W118株S1基因及N基因与14个参考毒株核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为71.0 %～85.3%和72.7%～83.9%及84.1%～95.7%和88.9%～96.1%,M基因与12个参考毒株核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为86.6%～98.1%和89.8%～98.2%;W118株的S1蛋白与IBV疫苗株H52、H120比较,在25aa位缺失一个氨基酸,73aa位插入了(T-N-G-N-D -V-G)7个氨基酸,其它区域存在多个点突变;S1蛋白潜在糖基化位点分析显示W118株与美国肾型Gray株、英国变异株793B在潜在糖基化位点上有相似性;W118株M蛋白在61aa, 204aa, 222aa出现了点突变,N蛋白在175～241aa抗原区域出现了5个点突变,这可能影响到此抗原区域的B细胞表位。W118株S1、M和N基因的缺失、插入和点突变,揭示了当前IBV弱毒疫苗H120、H52及W93临床保护力差的分子机制。3.运用生物信息软件对IBV W118株N基因蛋白的二级结构特点及抗原性进行了分析。结果表明,IBV W118株N蛋白的氨基酸组成和二级结构特点使其有利于与RNA结合,N蛋白的抗原性好并存在多个B细胞优势表位,与已鉴定的B细胞表位相比位置更明确。构建了W118株N基因原核表达载体N-pET32a,转化并筛选阳性克隆进行诱导表达,SDS- PAGE和Western-blotting检测表明,高量表达的N蛋白具有良好的反应原性,可用于IBV的诊断,为IBV ELISA检测试剂盒的开发提供了材料。4.重新设计一对引物扩增W118株N基因,将其PCR产物连接pMD18-T载体后,切下目的片段插入到复制型DNA疫苗载体pSCA1。BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定和序列测定结果表明,得到了N基因自杀性DNA免疫质粒W118N-pSCA1,这为进一步研究IBV N基因DNA疫苗提供了素材。有关W118株N基因自杀性DNA疫苗与S1基因的DNA疫苗或IBV分离株灭活苗的联合应用正在试验之中。从本研究的结果来看,8株IBV陕西分离毒N基因核苷酸及氨基酸序列均发生了一定的变异,并与我国疫苗株H120、H52和W93有较大差异,这也许是近年来我国IB疫苗免疫失败的原因之一。IBV W118株主要结构基因(特别是S1基因)的序列分析,揭示了其作为灭活苗制苗毒株能有效预防肾型IBV地方流行强毒株的分子机制以及H120、H52和W93弱毒株在IB临床免疫预防上的缺陷。本研究不仅为新型IBV基因工程疫苗的开发提供了理论依据,而且也丰富了我国IBV的分子流行病学资料。