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足细胞(Podocyte)即肾小球脏层上皮细胞(Glomerular Visceral Epithelial Cell),是一种具有高度特异性且终级分化的细胞,不具有增殖特性。足细胞损伤、脱落或凋亡是肾小球硬化起始和进展的主要原因,而介导足细胞凋亡的启动因子及发病机制尚不清楚。环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)是前列腺素合酶的同工酶,其表达部位在肾小球皮质的致密斑、髓质间质细胞及亨氏襻升支粗段。有研究报道在人类肾小球足细胞可检测到COX-2表达,且在肾大部切除、Thy-1肾炎、糖尿病肾病大鼠模型中足细胞COX-2的表达显著增强。已有动物实验表明特异性COX-2抑制剂对许多慢性肾脏疾病有减轻蛋白尿,延缓肾损害进展的作用,但作用机制尚未完全阐明。本研究旨在通过特异性COX-2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)对嘌呤霉素氨基核苷(Puromycin Aminonucleoside,PA)诱导的足细胞凋亡的影响,进一步探讨特异性COX-2抑制剂对足细胞保护作用的分子机制,为临床对慢性进行性肾损害的防治探索出新的治疗靶点。方法1.将体外培养的条件永生性小鼠足细胞复苏并传代培养,并用PA干预足细胞诱导其凋亡,采用Western blot法分析COX-2在凋亡足细胞中的表达。为进一步研究特异性COX-2抑制剂塞来昔布对PA诱导的足细胞凋亡的影响建立实验基础。2.以条件永生性小鼠足细胞株为研究对象,实验分为8组:正常对照组(CON)、嘌呤霉素氨基核苷组(PA)、地塞米松组(DEX)、地塞米松+嘌呤霉素氨基核苷组(DEX+PA)、氯沙坦组(LOS)、氯沙坦+嘌呤霉素氨基核苷组(LOS+PA)、塞来昔布组(CEL)和塞来昔布+嘌呤霉素氨基核苷组(CEL+PA),在0h,8h,24h和48h对体外培养的足细胞分别用MTT比色法和Hoechst 33258荧光染色法检测足细胞活性和凋亡水平;用Caspase-3活性检测试剂盒检测凋亡过程中caspase-3蛋白酶的活性水平;用Western blot技术检测凋亡过程中p53及COX-2水平。结果1.在33℃增殖状态下,足细胞呈鹅卵石状,在37℃分化状态下的足细胞呈分叉状。在37℃分化14d后,用低血清培养液培养后,给予PA干预后,随时间延长,PA诱导的足细胞凋亡逐渐增多,在24h及48h COX-2表达明显增加。2.与正常对照组比较,LOS、CELE、DEX组足细胞凋亡率无明显变化(P＞0.05),PA组凋亡率在24h及48h明显增高(P＜0.05),而LOS+PA、CELE+PA、DEX+PA组凋亡率在24h及48h比正常对照组升高,但较PA组明显下降(P＜0.05)。3.与正常对照组比较,LOS、CELE、DEX组足细胞增殖活性无明显变化(P＞0.05),PA组增殖活性在24h及48h明显下降(P＜0.05),而LOS+PA、CELE+PA、DEX+PA组增殖活性在24h及48h比正常对照组下降,但较PA组明显升高(P＜0.05)。4.各组caspase-3活性无明显差异(P＞0.05)。5.在24h及48h时,PA组p53表达较正常对照组明显增多,用LOS、CELE、DEX干预后明显降低(P＜0.05)。6.正常对照组表达COX-2,用PA诱导凋亡后,24h及48h时COX-2表达明显增加,用LOS、CELE、DEX干预后COX-2表达水平有所减少(P＜0.05)。结论1.COX-2在凋亡足细胞中的表达呈时间依赖性。2.塞来昔布可以抑制PA诱导的足细胞凋亡,p53参与了PA诱导的足细胞凋亡过程,塞来昔布抑制PA诱导的足细胞凋亡的可能与足细胞所表达的COX-2水平有一定相关性。