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目的:本研究首先以肿瘤特异性启动子替换pEGFP-C1载体中的CMV启动子,构建携带Survivin启动子的真核表达质粒pEGFP-C1/Surp,分别转染肺癌A549及人胚成纤维细胞MRC-5比较其肿瘤特异性;以基因SOEing法扩增sea-pnp融合基因,构建pSGFP-SEA-PNP真核表达质粒;通过RT-PCR鉴定重组质粒在A549细胞中的特异性表达;通过PBMC刺激实验以MTT法检测表达产物的超抗原活性;以MTT法检测重组质粒在A549细胞中的表达产物将低毒的氟阿糖腺苷-磷酸(F-ara-AMP,fludarabine,氟达拉滨)转化为高毒性2-氟腺嘌呤(2-F-adeninie,2-F-A)的细胞毒作用。本研究旨在为探索肺癌及其它肿瘤的靶向基因治疗途径及机理奠定基础。方法:1.用PCR法和基因克隆技术在真核表达质粒pEGFP-C1基础上构建Survivin启动子调控的、以绿色荧光蛋白为目的基因的真核表达质粒pSGFP(pEGFP-C1/Surp)。2.将该重组质粒和pEGFP-C1分别用脂质体转染人肺腺癌细胞(A549)和人胚肺成纤维细胞(MRC-5),72h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,并用Imagepro-Plus6.0分析Survivin启动子在肺癌细胞内特异启动绿色荧光蛋白的表达水平。3.以ATCC25923金黄色葡萄球菌基因组为模板,PCR扩增sea基因,以JM109大肠杆菌基因组为模板,PCR扩增PNP基因,然后以SOEing法构建sea-pnp融合基因。以pSGFP为基础,构建pSGFP-SEA-PNP真核表达质粒;用脂质体将该质粒转染A549细胞,72h后提取总RNA,通过RT-PCR鉴定重组质粒在A549细胞中的特异性表达。4.用脂质体将pSGFP-SEA-PNP质粒转染A549细胞,72h后,收集细胞培养的上清液和转染细胞裂解液。制备健康献血者PBMC,用上清液和细胞裂解液进行PBMC刺激实验,用MTT法、通过比较刺激指数以检测其促细胞增殖效应。5.用脂质体将pSGFP-SEA-PNP质粒转染A549细胞,36h后,更换有效浓度的氟阿糖腺苷-磷酸(F-ara-AMP,fludarabine,氟达拉滨)培养液,MTT法检测其杀瘤效应。结果:1.经限制性内切酶酶切及DNA测序证实pSGFP(pEGFP-C1/Surp)真核表达质粒构建成功;将重组质粒及pEGFP-C1分别转染A549细胞和MRC-5细胞72h后,在转染重组质粒的A549细胞中观察到了绿色荧光蛋白的表达,而在MRC-5细胞中无绿色荧光蛋白表达;在转染pEGFP-C1的两种细胞中均观察到绿色荧光蛋白的表达。经Imagepro-Plus6.0分析,在A549细胞中Survivin启动子启动活性约为CMV启动子活性的65.15%。2.经限制性内切酶酶切及DNA测序证实pSGFP-SEA-PNP真核表达质粒构建成功。质粒转染A549细胞后,RT-PCR结果表明,pSGFP- SEA-PNP质粒在A549细胞中成功表达了sea-pnp目的基因。3.经MTT实验结果证实,pSGFP-SEA-PNP质粒转染A549细胞的裂解液具有促进人PBMC增殖活性、上清液无明显促PBMC增殖作用;裂解液实验组、上清液实验组和PHA阳性对照组的刺激指数分别为1.290、0.855和1.637。4.经MTT实验结果证实,经pSGFP-SEA-PNP质粒转染A549细胞后所表达的产物能将F-ara-AMP转化形成高毒性2-F-A,对A549细胞有一定杀伤作用。结论:1.成功构建了肿瘤特异性启动子Survivin调控的、以绿色荧光蛋白为目的基因的真核表达质粒,该启动子表现出肿瘤特异性,且在肺癌A549细胞中具有较好的启动效应。2.成功构建Survivin启动子调控的、以sea-pnp融合基因为目的基因的真核表达质粒pSGFP-SEA-PNP,并在A549细胞中启动了sea-pnp基因的表达。3. pSGFP-SEA-PNP质粒在A549细胞的表达产物,具有诱导人PBMC增殖的超抗原活性,同时该表达产物具有将F-ara-AMP转化形成高毒性2-F-A的作用,可以杀伤A549细胞。