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目的： 流行病学调查显示，过敏性哮喘和幽门螺杆菌感染呈负相关性。本研究将可致耐受粘膜佐剂霍乱毒素B亚单位（CTB）与幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP）融合表达于枯草芽孢表面。用表面表达CTB-NAP重组枯草芽孢口服免疫小鼠，并用卵清蛋白（OVA）诱导建立小鼠哮喘模型，评估口服枯草芽孢对哮喘小鼠的保护作用，为重组CTB-NAP枯草芽孢临床应用研究奠定基础。 方法： CTB和NAP重组蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及抗血清的制备：丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导pET28a-CTB/BL21和pET28a-NAP/BL21融合蛋白的表达，使用镍离子亲和层析法纯化的rCTB和rNAP蛋白。用纯化的rCTB和rNAP重组蛋白皮下注射免疫大鼠，得到特异性抗血清。 CotC-CTB-NAP枯草芽孢载体的构建：设计特异性引物，PCR扩增CTB基因，将CTB基因插入到pET28a-NAP质粒NAP的上游，转化E.coli BL21。以pET28a-CTB-NAP质粒为模板， PCR扩增CTB-NAP基因，将其亚克隆入Pus186CotC质粒，转化枯草芽孢杆菌WB600。挑取经卡那霉素筛选的阳性菌落提取质粒，进行双酶切、PCR鉴定及测序分析。 芽孢的制备及重组芽孢Western Blot分析：用营养耗竭法， DSM（ Difco Sporulation Medium）培养基诱导芽孢产生，用特异性抗血清进行Western Blot分析验证重组蛋白在芽孢外壳的表达。 重组芽孢免疫小鼠及哮喘的激发：分别用CotC、CotC-CTB、CotC-CTB-NAP芽孢口服免疫小鼠，以Nave组和Asthma组作对照。腹腔注射致敏乳液致敏小鼠和1％OVA雾化激发。在最后一次雾化24-48 h内采血、收集肺泡灌洗液（BALF）、提取脾细胞进行培养，并进行肺组织切片H&E染色，评估气道炎症情况。并在固定时间收集血清和粪便，用ELISA检测血清中OVA特异性IgENAP和特异性IgG、IgG1及IgG2a，粪便总IgA和OVA特异性IgA。ELISA检测BALF和脾细胞培养液中IL-4、IL-10、IFN-γ细胞因子水平，流氏细胞仪检测脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞数量。 结果： PCR扩增出753 bp左右片段并将其成功克隆入Pus186CotC载体，测序结果显示CTB-NAP在正确阅读框中，本实验成功构建了表面表达重组枯草芽孢质粒（Pus186CotC-CTB-NAP）。重组芽孢SDS-PAGE显示在37.4 KDa处可见清晰的重组蛋白条带，Western Blot显示CotC-CTB-NAP在芽孢外壳蛋白中融合表达，重组蛋白具有良好的反应原性。 与非重组CotC组相比，口服重组CotC-CTB和CotC-CTB-NAP芽孢小鼠血清OVA特异性IgE(p＜0.001)显著降低，和粪便IgA(P＜0.01)显著升高。ELISA结果显示CotC-CTB-NAP芽孢组血清中NAP特异性IgG、IgG1、IgG2a显著升高。BALF细胞分类计数发现CotC-CTB（P＜0.01）和CotC-CTB-NAP（p＜0.001）芽孢能显著降低BALF中嗜酸性粒细胞百分比。BALF中细胞因子检测发现CotC-CTB和CotC-CTB-NAP芽孢能降低IL-4（P＜0.05），升高IFN-γ（P＜0.05），和IL-10（p＜0.001）。脾细胞培养液中细胞因子的变化趋势和BALF中一致，Th1型细胞因子升高和Th2型细胞因子降低。与非重组CotC组相比，CotC-CTB、CotC-CTB-NAP芽孢能使脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg显著升高（P＜0.05， p＜0.001），且CotC-CTB-NAP组比CotC-CTB更高（P＜0.01）。肺组织病理切片显示口服CotC-CTB-NAP芽孢小鼠有少量的嗜酸性粒细胞浸润，管腔内分泌物明显减少，上皮细胞和杯状细胞增生不明显，炎症表现比其它组轻。 结论： 口服重组CotC-CTB、CotC-CTB-NAP枯草芽孢能抑制OVA诱导小鼠过敏性哮喘，其效应机制可能与升高分泌性IgA及CD4+CD25+Foxp3+Treg相关，且重组CotC-CTB-NAP芽孢的效果优于CotC-CTB芽孢。