论文部分内容阅读
目的:(1)对SD大鼠库普弗细胞(Kupffer Cell,KC)进行分离、纯化及鉴定,获到较高纯度及活性的KC。(2)重组鼠IL-12腺病毒(Adv-mIL-12)转染KC,探索KC-Adv-mIL-12体外对SMMC-7721人肝癌细胞的生长抑制和诱导凋亡作用。(3)观察KC-Adv-mIL-12对裸鼠SMMC-7721人肝癌细胞移植瘤的生长抑制效应,研究其抑瘤机制及对裸鼠免疫功能的影响。方法:(1)采用Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶E(PronaseE)离体灌注消化,Nycodenz密度梯度离心法得到SD大鼠肝脏非实质细胞(nonparenchymal cells,NPC),经选择性贴壁法纯化KC;台盼蓝拒染实验判断细胞存活率;细胞自发荧光现象、吞噬实验及ED-2单克隆抗体染色法对KC进行鉴定。(2)通过QBI-293A细胞完成重组腺病毒(Adv-mIL-12和Adv-EGFP)的扩增及效价检测;Adv-mIL-12、Adv-EGFP 50MOI转染KC,探讨转染率及IL-12分泌量;96孔细胞培养板共培养不同形式KC及SMMC-7721人肝癌细胞,效靶比为20:1、10:1、5:1、2.5:1,设七组:SMMC-7721、KC、KC-Adv-EGFP、KC-Adv-mIL-12、KC+SMMC-7721、KC-Adv-EGFP+SMMC-7721和KC-Adv-mIL-12+SMMC-7721,设三复孔,于共培养1、2、3、4、5、6及7天行MTT,检测SMMC-7721人肝癌细胞抑制率的变化;取24孔细胞培养板按上述方式共培养不同形式的KC和SMMC-7721人肝癌细胞,效靶比5:1,收集1、2、3、4、5、6及7天的细胞培养上清,ELISA法检测上清中VEGF的表达量;取不同形式的KC在24、48及72h三个时间段的培养上清,按比例作用SMMC-7721人肝癌细胞,48h后FCM检测肝癌细胞凋亡率。(3)制备裸鼠SMMC-7721人肝癌细胞移植瘤模型,随机分五组:对照组NS、Adv-mIL-12、KC、KC-Adv-EGFP及实验组KC-Adv-mIL-12,每4天行瘤内、瘤周注射一次,共三次,每次用药前及最后一次用药后7天分别测皮下瘤体的长径(L)、短径(R),计算瘤体体积;末次注射后7天,眼眶取血行血常规检测,视白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等比值;摘取脾脏,计算脾脏指数(SI);取瘤体行RT-PCR和免疫组化,检测VEGFmRNA的表达及PCNA、Bel-2、CD34阳性率,观察肿瘤细胞增殖情况及微血管密度(MVD)。结果:(1)每只SD大鼠可得到1.O～1.5×10~7个KC,细胞的存活率在93%以上;ED-2单抗染色鉴定KC纯度可达95%。(2)重组腺病毒Adv-mIL-12和Adv-EGFP经扩增后效价分别约2.0x10~9pfu/ml和3.0x10~9pfu/ml;Adv-mIL-12 50MOI转染KC,24h ELISA检测上清液中IL-12浓度为564.29±31.24 pg/ml,是对照组的10倍左右,并随时间延长继续升高;取相同滴度Adv-EGFP 50MOI转染KC,24h荧光观察转染率达90%;MTT提示:效靶比5:1时,第4d实验组(KC-Adv-mIL-12+SMMC-7721)肝癌细胞抑制率为50.12%,而对照组(KC+SMMC-7721)仅为25%,两者有显著性差异;ELISA检测:VEGF的表达量在实验组呈下降趋势,并与时间呈负相关,与对照组比较差别明显;FCM检测:48h时,KC-Adv-mIL-12上清组中SMMC-7721人肝癌细胞组凋亡率达12.2%,较对照组明显增加。(3)裸鼠体内实验发现实验组(KC-Adv-mIL-12)瘤体体积161.84 mm~3,对照组(NS)体积637.75mm~3,两者比较有统计学意义;实验组脾脏指数及外周血免疫细胞数等较对照组均有所增加;肿瘤组织切片HE染色提示实验组肿瘤细胞异型性减少、瘤组织中有明显的淋巴细胞浸润;对其肿瘤组织行RT-PCR发现,VEGF mRNA在实验组中的表达较对照组下调;肿瘤组织免疫组化提示:实验组PCNA、Bcl-2阳性细胞比率较对照组明显减少、CD34染色标记测定MVD较对照组相比也呈下降趋势。结论:(1)采用Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶E离体灌注消化,Nycodenz密度梯度离心及选择性贴壁法能够得到一定数量级别的KC,其纯度和活性能满足进一步实验要求。(2)Adv-mIL-12在体外能有效地转染KC和表达IL-12;KC-Adv-mIL-12和SMMC-7721人肝癌细胞共培养时能提高对肝癌细胞的抑制率、加速肿瘤细胞调亡。(3)瘤内、瘤周注射KC-Adv-mIL-12能有效的抑制裸鼠肝癌移植瘤的发展、阻止瘤体微转移,并能提高机体免疫力。