肥胖是多种慢性代谢性疾病包括2-型糖尿病、冠状动脉粥样硬化、慢性肾病、高血压及各种癌症的共同病理基础。肥胖所带来的潜在危害正渐渐受到人们的重视,迄今为止我们尚不明确肥胖的发病机制,研究发现肥胖可以导致机体长期处于一种系统性的慢性炎症状态这是引发胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)的诱因之一。胰岛素抵抗在临床上被定义为胰岛素不能适当地指导其生理作用。2018年决明子被收录在药食同源种药材中,有着悠久的药用历史,可用于治疗青光眼,高血脂以及防止肝脏损伤等方面。橙黄决明素(Aurantio-obtusi,AUR)是决明子中有效成分之一,近年来研究发现橙黄决明素有抗炎和调节血脂的作用,根据蒽醌类药物现有的研究基础显示,橙黄决明素在改善胰岛素抵抗有一定的成效,但其作用机制尚不明确。鉴于此,本课题从整体动物、体外实验、网络药理三个方面,开展橙黄决明素对改善胰岛素抵抗体内和体外的作用机制研究,阐明橙黄决明素改善胰岛素抵抗的作用机制,为橙黄决明素在调节糖脂代谢研究和临床应用等方面提供科学依据。方法:(1)橙黄决明素对高脂诱导的C57BL/6J肥胖小鼠糖脂代谢的作用C57BL/6J小鼠共32只,取24只C57BL/6J小鼠用高脂饲料喂养诱导小鼠产生食源性肥胖模型。然后将所有小鼠分为正常组(NFD,n=8)、模型组(HFD,n=8)、橙黄决明素低浓度组(HFD+5AUR,n=8)、橙黄决明素高浓度组(HFD+10AUR,n=8)。正常组和模型组分别灌胃同等剂量的生理盐水,橙黄决明素低浓度组给予5 mg/kg浓度的AUR混悬药液,橙黄决明素高浓度组给予10 mg/kg浓度的AUR混悬药液。第6、9、11周时,采用断尾法测定小鼠的空腹血糖,并在第11周测定小鼠的口服葡萄糖耐量。在第12周摘除眼球取血后颈椎脱臼处死小鼠,取肝脏和白色脂肪组织称量脏器湿重后将组织冻存或固定。检测小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT和AST的含量。将小鼠的肝脏组织制成切片进行HE染色和油红O染色等处理,镜检并分析组织形态变化和脂质沉积等情况。(2)橙黄决明素对高脂诱导的C57BL/6J小鼠胰岛素抵抗的作用机制研究取部分冻存的肝脏组织制备成组织匀浆,用ELISA法测定肝脏组织中TG、TC指标的表达。称取肝脏和附睾白色脂肪,按照组织:蛋白酶抑制剂:裂解液=10 mg:1μL:100μL比例加入裂解液提取组织蛋白测定蛋白浓度以后,用Western blot的方法测定肝脏和白色脂肪组织中PI3K,Akt,p-Akt和GLUT4蛋白的表达,肝脏组织中GLUT2蛋白的表达和脂肪组织中PPARγ蛋白的表达。取各组肝脏组织的切片,用免疫组织化学技术检测肝脏组织中GLUT4蛋白的表达。称取肝脏和附睾白色脂肪提取mRNA后用荧光定量PCR技术测定肝脏和白色脂肪组织中PI3K、Akt、p-Akt、GLUT4、PPARγ和PPARα基因的表达,和脂肪组织中CPT-1、UCP-2、SREBP-1c、FAS和SCD-1基因的表达。(3)融合网络药理学研究橙黄决明素对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响将细胞吹打后制成细胞悬液,空白组加入100μL完全培养基,溶剂对照组和给药组每孔加入100μL细胞悬液,每孔约为5×10~3个细胞,每组重复6个复孔。细胞密度培养至70%～80%时,空白组和溶剂对照组分别加入100μL的DMEM,给药组加入的AUR浓度分别为0.8,1.6,3.1,6.2,12.5,25,50(μg/mL),培养24 h和48 h后用CCK-8筛选AUR合适的浓度。将3T3-L1细胞接种于6孔板中按照经典激素鸡尾酒的方法进行3T3-L1细胞诱导分化实验。诱导分化过程中持续给予AUR干预,剂量为:空白组;溶剂对照组:1%EtOH;0.8μg/mL AUR;1.6μg/mL AUR;3.1μg/mL AUR;6.2μg/mL AUR。在光学显微镜下拍照记录细胞形态的变化,对各组细胞进行油红O染色,并测定各组细胞油红O染料的吸光度。通过中药系统药理学数据库与分析平台,筛选决明子中的有效化合物。将筛选后的有效成分的靶点基因与所得的疾病基因进行匹配,构建有效化合物-靶点基因-疾病网络,对关键靶点基因进行GO富集分析与KEGG信号通路分析。结果:(1)AUR可以明显降低C57BL/6J肥胖小鼠的血糖血脂水平,降低肝脏组织中脂质的积累,改善机体肝脏组织细胞的形态,减少机体白色脂肪的堆积,改善C57BL/6J肥胖小鼠糖脂代谢紊乱。AUR可以通过保护小鼠的肝脏组织,改善机体脂代谢紊乱,减少白色脂肪的积累来改善胰岛素抵抗。(2)AUR可以通过PI3K/Akt/GLUT4胰岛素信号通路,增加机体葡萄糖的消耗量,降低C57BL/6J肥胖小鼠的血糖水平。AUR可以增加脂肪组织中PPARγ和PPARα的表达,促进脂肪细胞的分化,增加机体对胰岛素的敏感性,促进CPT-1和UCP-2的表达,促进白色脂肪的转化。抑制脂肪组织中SREBP-1c、FAS和SCD-1基因的表达,抑制脂肪信号通路的传导,减少脂质的合成,改善胰岛素抵抗。AUR促进GLUT2和PPARα在肝脏组织中的表达,提高肝脏葡萄糖的消耗。AUR促进脂联素基因的表达,抑制炎症通路反应进而抑制炎症因子的表达,改善肥胖导致的慢性炎症。(3)CCK-8对AUR浓度进行筛选后,我们选择0.8μg/mL,1.6μg/mL3.1μg/mL,6.2μg/mL这四个对3T3-L1细胞没有明显细胞毒性的浓度作为后续实验的药物浓度。诱导分化至第10天,光学显微下观察可以看出经过AUR干预后的细胞分化程度大于空白组和溶剂对照组细胞的分化程度,且浓度越高,细胞的分化程度越大。诱导分化进行到第11天时,通过油红O染色发现细胞内出现围绕着细胞核分布的脂滴被染成橘红色,并且经过AUR干预的细胞内的脂滴明显增多,AUR浓度越大脂滴数目越多,细胞分化程度越大。通过网络药理学构建的“药物—靶点—疾病”网络图结果分析我们发现AUR与IR相关靶点结合效果最好的分别是PTGS2和NCOA2两个靶点,其中PTGS2参与了PI3K/Akt通路在抗炎和改善胰岛素抵抗等方面发挥了作用,NCOA2则是前脂肪细胞分化的辅助激活因子与前脂细胞的增殖和分化有着密切的关系。结论:综上所述,AUR可以降低肝脏组织中脂质的积累,改善机体肝脏组织细胞的形态,减少机体白色脂肪的堆积,改善C57BL/6J肥胖小鼠糖脂代谢紊乱。AUR可以通过激活PI3K/Akt/GLUT4胰岛素信号通路,增加机体中GLUT4对葡萄糖的转运,降低C57BL/6J肥胖小鼠的血糖水平。AUR通过促进脂联素基因的表达,提高机体对胰岛素的敏感性,抑制炎症通路反应进而抑制炎症因子的表达,改善肥胖导致的慢性炎症。AUR可以促进3T3-L1细胞的分化,网络药理学结果显示AUR可以作用于PTGS2、NCOA2两个靶点,在抗炎,促进前脂细胞增值分化和改善胰岛素抵抗等发面发挥了作用。